Summary
Este protocolo ilustra a técnica para extrair óvulos ou embriões em estágio inicial fertilizado do oviduto de camundongos. A capacidade de identificar o infindibulum e inserir uma agulha na extremidade sem corte, é essencial a correta execução do procedimento.
Abstract
Até o momento, poucos estudos têm relatado manipulações sucesso da embriogênese Peromyscus ou biologia reprodutiva. Juntamente com o Peromyscus genética de Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), estamos caracterizando as diferenças importantes necessários para desenvolver este sistema. A meta principal tem sido a de otimizar oócito / recuperação embrionária precoce.
Protocol
Embrião / oócito de recuperação
- Pelo menos duas horas antes da recuperação de embriões / óvulos, KSOM é colocado na 37 º C incubadora de CO 2 e FHM devem ser descongeladas de -20 °. Um prato de vidro contendo três poços rasos côncava é usada para casa de gotas KSOM na incubadora. Para evitar a desidratação, o KSOM e prato são colocados em um recipiente com tampa que tem água no fundo. Este aparelho evita a evaporação, sem o uso de óleo mineral.
- As tubas uterinas de uma fêmea a ovular são colocados na mídia FHM. Para garantir a orientação e um infindibulum intacto, uma pequena seção do ovário é cortado juntamente com a seção de oviduto e pequenas do útero. A agulha de calibre blunt 30 é utilizado para expulsar embriões / óvulos do oviduto, inserindo a agulha com no infindibulum. O infindibulum deve ser usado para recuperar os embriões já que a tubulação oviduto é pequena demais para uma agulha para passar. No caso em que o infindibulum é destruído, o oviduto deve ser cortado aberto ou embriões espremido.
- Embriões / óvulos são encontrados na mídia FHM, concentrando-se o microscópio sobre a gotículas de gordura que têm afundado até o fundo da placa de Petri. Embrião / óvulo isolamento pode ser obtida em 20x, pois isso proporciona uma maior área de visualização de alta ampliação. Embrião / ovócitos parece rodada gotículas de gordura que tem um anel claro em torno dele. Pipetar à boca, usando um copo puxado capilar, é usado para mover os embriões / óvulos para KSOM para incubação e de manipulação posterior.
Procedimento para a recuperação de oócitos
Preparação
- Descongelar FHM e preparar KSOM.
- Poucas horas antes, KSOM colocados no recipiente de recuperação de ovo e coloque na caixa de ponta com água no fundo, coloque na incubadora de CO 2.
- Traga gaiolas para o laboratório e matar as fêmeas colheita.
- Cortar o oviduto tendo o cuidado de cortar algumas do ovário e alguns do útero para garantir que você não cortou parte do oviduto.
- Lugar na mídia FHM em placa de Petri pequena.
- Despeje mais um par de pratos FHM media Petri a ser utilizada para a descarga.
Flushing
- Use uma agulha de lavagem (30 gauge blunt) conectada a uma agulha de 1ml, com fim em espiral.
- Tome um oviduto em um tempo e usando agulha, inserir no infundíbulo encontrado perto da parte do ovário esquerdo anexado. Se o infundíbulo é destruído e não pode ser usado, em seguida, tomar duas pinças e segure uma extremidade do oviduto. Com a pinça outro, aperte delicadamente, como um tubo de creme dental, para ejetar qualquer do embrião.
Nota: Isto irá criar uma grande quantidade de sujeira na placa de Petri, como um monte de tecido virá com ele, assim que você pode querer usar uma placa de Petri diferente depois.
- Para ver os embriões, o foco do microscópio em pedaços de gordura e procure por "pedaço de gordura" círculo redondo com clara em torno dele.
Nota: Os embriões têm a mesma aparência que a gordura, por isso pode ser difícil de encontrar. Os embriões vão para o fundo, assim que olhar lá.
- Fazer esfregaços vaginais de fêmeas destinatário. Nesta fase, devem ser pseudopregnant.
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Discussion
Neste artigo, demonstramos a recuperação de ovócitos de ovulação induzida (superovuladas) Peromyscus. O uso de superovulação (em oposição ao ciclo estral natural) é comum, devido ao número muito maior resultante. No entanto, o cuidado deve ser tomado na interpretação dos resultados utilizando oócitos tais / embriões, já que ambos os hormônios usados para induzir a ovulação e cultura podem ter efeitos.
Quando estral foi confirmado, as fêmeas são euthenized e tubas uterinas recuperados, juntamente com uma pequena porção de ovário. A pequena região do ovário é usado como um marcador para a localização do infindibulum. O infindibulum se senta ao lado do ovário, muitas vezes projetando através de uma fina camada de tecido. Do outro lado deste tecido, o resto do oviduto é enrolada e, eventualmente, leva para a vagina. É melhor para empurrar o fluido através infindibulum para extrair os óvulos. Essa direção é necessária devido a uma válvula de sentido único localizado na interface da vagina do oviduto. Os ovócitos podem ser prejudicados se forem projetado para trás através da válvula.
A 30-gaugle agulha sem corte final é inserido no infindibulum. A agulha ponta cega vai caber a abertura infindibulum, mas não vai caber no tubo de oviduto. Portanto, cuidados devem ser tomados para garantir a infindibulum não está danificado durante a dissecção ou recuperação de oócitos. Se o infindibulum está danificado, o tubo pode ser extraído do oviduto via fórceps para permitir que qualquer oócitos preso para sair.
Assumindo que a fêmea estava no cio, os órgãos reprodutivos terá uma aparência vermelha, devido à maior fornecimento de sangue e parecem inchados. Observamos diferenças nas duas espécies de veados rato testados: P. polionotus tinha ovários e tubas uterinas muito fattier que P. maniculatus, fazendo recuperação de oócitos mais difícil.
Uma vez que os ovócitos têm retirado do oviduto, podem ser observados por microscopia de luz em baixa ampliação. Vendo os ovócitos com menor ampliação permite ao utilizador digitalizar a placa de Petri rapidamente. O microscópio deve ser focada na camada inferior de grânulos de gordura. Os oócitos será semelhante perfeitamente redonda grânulos de gordura com um anel claro em torno do exterior. Para auxiliar na detecção de os oócitos, tente ajustar a luz projetando através da placa de Petri. Além disso, se a placa de Petri é levemente agitada oócitos não se moverá em comparação com as gotículas de gordura. Essas dicas podem ajudar o pesquisador iniciante para localizar os ovócitos, no entanto, é provável que vários estudos serão necessários antes de um se sente confortável com o procedimento.
Os ovócitos isolados podem ser usados em uma variedade de experimentos, incluindo a produção de linhas de células-tronco, a produção de quimeras, ou manipulações genéticas. Embora tenhamos encontrado uma variação considerável nos parâmetros eo calendário necessários para induzir a ovulação, as técnicas gerais para a recuperação deve ser aplicável a muitas espécies de roedores (ratos de cervos são ~ 30 milhões anos divergiram de ratos de laboratório e ratos). Estamos particularmente esperançoso de que isso irá beneficiar aqueles que trabalham em novos sistemas em que tais técnicas não estão bem estabelecidos.
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Acknowledgments
Gostaria de agradecer a Mike Dewey do Centro de Ações Peromyscus Genéticos para a sua ajuda, paciência e conhecimento.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flushing needle | Tool | Zephyrtronics | ZT5-130-L | 30 G blunt |
| Forceps (2) | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5060 | |
| Peromyscus | Animal | Peromyscus Genetic Stock Center | ||
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| FHM HEPES Buffered Media | Reagent | Specialty Media | MR-025-d | |
| KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL) | Reagent | Specialty Media | MR-020P-5F | |
| Mouth Pipette | Tool | Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing | ||
| Oocyte holding dish | Tool | Glass container with concave divets |
