Summary
Questo video dimostra il protocollo di un test in vitro angiogenesi che ricapitola diverse fasi di angiogenesi. Time-lapse immagini di germinazione, formazione lumen, ramificazione e anastomosi - caratteristiche fondamentali di angiogenesi - sono mostrati.
Abstract
L'angiogenesi è un complesso processo multi-step, dove, in risposta a stimoli angiogenici, vengono creati nuovi vasi da vasi esistenti. Questi passaggi sono: la degradazione della membrana basale, la proliferazione e la migrazione (germogliamento) delle cellule endoteliali (CE) nella matrice extracellulare, l'allineamento della CE in corde, rami, la formazione di lume, anastomosi, e la formazione di una nuova membrana basale. Molti test in vitro sono stati sviluppati per studiare questo processo, ma la maggior parte solo mimare alcune fasi dell'angiogenesi, e morfologicamente i vasi all'interno del test spesso non assomigliano vasi in vivo. Sulla base di un precedente lavoro di Nehls e Drenckhahn, abbiamo ottimizzato un test in vitro che utilizza angiogenesi umano vena ombelicale CE e fibroblasti. Questo modello racchiude in sintesi tutte le fasi fondamentali all'inizio di angiogenesi e, soprattutto, i vasi di visualizzazione brevetto lumen intercellulare circondato da polarizzata CE. CE sono rivestiti su microcarriers cytodex e incorporato in un gel di fibrina. I fibroblasti sono stratificate sulla parte superiore del gel in cui prevedono necessario fattori solubili che favoriscono CE spuntano dalla superficie delle perline. Dopo alcuni giorni, sono presenti numerosi vasi che possono essere facilmente osservati in contrasto di fase e microscopia time-lapse. Questo video illustra i passaggi chiave nella creazione di queste culture.
Protocol
CELLE DI PREPARAZIONE
- Portare HUVEC e fibroblasti in M199/10% FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 giorni prima della bordatura.
- Passa medio EGM-2 (Clonetics) il giorno prima per bordare HUVEC e il giorno prima di embedding per fibroblasti.
- Una concentrazione di ~ 400 HUVEC al tallone è necessario.
- 20.000 fibroblasti per pozzetto è necessario.
RIVESTIMENTO CON LE PERLE HUVEC - GIORNO -1
- Trypsinize HUVEC.
- Lasciare perle di stabilirsi (NON CENTRIFUGA!). Aspirare il surnatante e lavare le perline brevemente in 1 ml di caldo EGM-2 di media.
- 2500 perline mix w / 1x10 6 HUVEC in 1,5 mL di caldo EGM-2 di media in un tubo di FACS. Posto verticalmente all'interno dell'incubatore. (Questo sarà sufficiente per circa 10 pozzi. Scala fino, se necessario)
- Incubare per 4 ore a 37 ° C, agitando la provetta ogni 20 min. (Rivestimento Buona è fondamentale per la germinazione.)
- Dopo 4 ore, trasferire le perle rivestite per un pallone T25 in 5 ml di EGM-2 e lasciare O / N.
INCASSO PERLE RIVESTITO IN FIBRINA GEL - GIORNO 0
- Preparare il mg / ml soluzione di fibrinogeno 2,0 (vedi sezione ricette).
- Aggiungi 0,15 Unità / ml di aprotinina alla soluzione fibrinogeno.
- Trasferimento perle rivestite per un tubo 15 ml conica e lasciate perline stabilirsi. Perline risospendere in 1 ml di EGM-2 e trasferimento in un tubo da centrifuga 1,5 ml.
- Lavare le perle 3 volte con 1 ml di EGM-2 da pipeting su e giù lentamente.
- Contare perle su un vetrino e risospendere in soluzione fibrinogeno ad una concentrazione di circa 500 perline / mL.
- Aggiungi 0,625 Unità / ml di trombina in ciascun pozzetto.
- Aggiungere 0,5 ml di sospensione fibrinogeno / perla a ciascun pozzetto di una 24-pozzetti.
Cambia la punta della pipetta per ogni bene! - Mescolare la trombina e il fibrinogeno andando su e giù delicatamente con la punta della pipetta ~ 4 a 5 volte. Fare attenzione a non fare bolle di grandi dimensioni.
- Lascia la piastra per 5 minuti nel cofano, poi metterlo nel 37 ° C-incubatore per 10-15 minuti per generare un coagulo.
- In attesa del coagulo, trypsinize fibroblasti.
- Aggiungere 1 ml di EGM-2 per pozzetto goccia a goccia.
- Fibroblasti seme sulla cima di fibrina gel ad una concentrazione di 20.000 cellule per pozzetto.
NOTE:
Di solito, quando il gel di fibrina si forma, si vedrà bollicine nel gel. Non preoccupatevi, spariranno in 3-4 giorni.
Cambiare il supporto a giorni alterni, cioè, Giorno 2, 4, 6, ecc ..
Di giorno 3 o 4 si dovrebbe iniziare a vedere germogliare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C'è un consenso crescente che tridimensionali (3D) saggi in vitro angiogenesi offrire un modello che è molto più vicino all'ambiente reale in vivo che può essere raggiunto utilizzando culture 2D. È evidente che sistemi 3D superiore dovrebbe essere riproducibile, ed essere in grado di mimare alcuni dei passaggi principali di angiogenesi. Mentre diversi saggi precedenti 3D sono stati sviluppati, molti di questi utilizzare difficili da ottenere cellule microvascolari, o solo ricapitolare alcune delle tappe. In questo video, si descrive e ottimizzato per eseguire un test in vitro che utilizza l'angiogenesi umano vena ombelicale CE, che sono facilmente reperibili e il più comunemente usato CE nella ricerca vascolare. Il dosaggio, nel corso di diversi giorni, si riproduce costantemente imbarcazioni lungo con chiare, lumen brevetto intercellulare circondato da polarizzata CE. Fasi successive di CE ramificazione e fusione dei vasi (anastomosi) sono anche osservati. È importante sottolineare che in queste culture le HUVEC subire tutti i cambiamenti morfologici che sono visti con microvascolare CE, in vivo o in vitro, tra cui spuntano, la migrazione, l'allineamento, la proliferazione, la formazione di tubi, ramificazioni e anastomosi. Il profilo di espressione genica dei cambiamenti HUVEC, in parallelo, per una maggiore corrispondenza tra quello di microvascolari CE. In conclusione, presentiamo un protocollo ottimizzato per un modello in vitro angiogenesi che ricapitola diverse fasi importanti di questo processo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
