Biology

Incorporação de plástico e secção de embriões Xenopus laevis

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/188

Souichi Ogata¹, Shimako Kawauchi¹, Anne Calof², Ken W.Y. Cho¹

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI), ²University of California, Irvine (UCI)

Summary

Perfis plásticos manter morfologia do tecido verdadeiro em seções de tecido fino que pode ser imunocoloração com fluorescentes anticorpos secundários, tornando este método mais útil do que seções parafina ou congelados para muitos tipos de tecido. O método para a coloração, a incorporação de plástico, e secção é demonstrada neste vídeo.

Protocol

Fixação

Transferência de embriões todo ou explantes dissecado em MEMFA ou 3,7% FA + PBS em um pequeno frasco de vidro de cintilação (Fisher cat # 03-339-25B). Incubar frasco na nutator na RT, somente por 2 horas, e não mais do que isso. Não deixe o embrião na FA por mais de duas horas. Mais incubação em FA fará o tecido embrionário mais difícil e resultar em uma penetração pobres de anticorpos no processo de detecção.
Aspirar a maioria das FA e adicionar fixador Dent até o topo do frasco (~ 4,5 ml). Inverta suavemente o frasco para algumas vezes para lavar os embriões em Dent, a troca com outro 4.5ml de fresco Dent, e incubar em -20 º C durante pelo menos 48 horas. Durante a noite não é suficiente. Essa etapa faz os embriões mais permeável para o anticorpo. Embriões pode ser mantido nesta condição por várias semanas.

Imunofluorescência

Reidratar a amostra. Incubar em uma série graduada de metanol, como segue:

75% MeOH / H ₂ O 10min
50% MeOH / PBS 10min
25% MeOH / PBS 10min
PBS 10min
PBS 10min
Faça agarose 1,5% / PBS placas com 60 milímetros pratos de plástico. Despeje PBS em cima do agarose depois tornou-se sólido.
Hemi-secção da embriões: Coloque os embriões em uma placa de agarose 1,5% / PBS. Agarre um embrião com um par de fórceps e corte-o ao meio através do centro do embrião usando uma lâmina fina. Escolha os que você tem com sucesso cortado ao meio com um plano de corte reto.
Transferir os embriões bisected em um frasco de cintilação de vidro com PBT. Intercâmbio com 4,5 ml de soro de cabra 20% + PBT. Incubar a RT por 2 horas em um nutator (bloqueio).
Preparar uma diluição adequada do anticorpo primário em PBT. 0,5 ml de amostras por isso é necessário. Por exemplo, eu usei 1 / 200 de diluição de coelho anti-C-caderina PAB para estudar a localização subcelular de C-caderina em 5 milímetros seções de plástico.
Aspirar a solução de bloqueio e adicionar 0,5 ml do anticorpo diluído primária. Colocar os frascos na posição de stand-up em um tubo de suporte de isopor. Incubar overnight a 4 º C em um nutator.
Remover o anticorpo diluído primário (este anticorpo diluído primárias podem ser salvas e reutilizadas nos próximos 1-2 semanas). Lavar com 4.5ml de PBT por 4 vezes (40-60 minutos cada) em temperatura ambiente.
Intercâmbio com 0,5 ml da diluição 1 / 100 de Biotina-conjugado anticorpo secundário em PBT. Incubar overnight a 4 º C em um nutator. Cobrir os frascos com papel alumínio para proteger da luz biotina.
A partir deste ponto, deve ser tomado cuidado para proteger a amostra da luz ou seja, manter os frascos em algumas tampa ou papel alumínio.
Remover o anticorpo Biotina-secundário (este também pode ser reutilizado nos próximos 1-2 semanas). Lavar com ou 4.5ml de PBT por 4 vezes (40-60 minutos cada) em temperatura ambiente.
Intercâmbio com 0,5 ml de 1 / 200 de diluição de fluorescência-rotulados (FITC, Texas-vermelho, etc) Estreptavidina em PBT. Incubar overnight a 4 º C em um nutator.
Remova a estreptavidina (este pode ser reutilizado, também). Lavar com 4.5ml de PBT por 3 vezes (15-30 minutos cada) em temperatura ambiente.
Fixar os embriões em 4,5 ml de 3,7% FA + PBS por 30 minutos em temperatura ambiente.
Lavar com 4,5 ml de PBS duas vezes.
Desidratar a amostra. Incubar em uma série graduada de etanol, como segue:

30% EtOH / H ₂ O 10 min
50% EtOH / H ₂ O 10 min
75% EtOH / H ₂ O 10 min
100% EtOH 10 min
O espécime pode ser armazenada em 100% EtOH a 4 º C com uma capa para protegê-lo da luz.

Infiltração

Faça Technovit mix infiltração 7100. Eu costumo tomar 15ml do líquido de base em um tubo de 50ml cónico, juntar 150mg de endurecedor I e misturá-lo balançando em um nutator por 15 minutos. Esta mistura de infiltração pode ser mantido a 4 ° C por até um mês.
Infiltrar-se na amostra com a mistura de infiltração por troca com uma série graduada de infiltração Technovit combinação mix / EtOH, como segue:
1. 50% Technovit / EtOH - 1 hora
2. 100 Technovit% - 1 hora
3. 100 Technovit% - durante a noite
O specimen pode ser armazenado no mix de infiltração de 100% para até um mês a 4 º C. Colocar uma cobertura sobre as amostras para protegê-los da luz.

Incorporação

Faça Technovit mix incorporação de 7100: Take 0.75ml do mix de infiltração em um tubo de 1,5 ml e adicione 50 ml de endurecedor II. Misturá-lo por vezes invertendo o tubo várias.
Usando uma pipeta de plástico, tomar um espécime infiltrado overnight em 0,5 ml fino tubo de PCR parede. Remover a maior parte do sobrenadante.
Adicionar 0,25 ml da mistura de incorporação feito na etapa 1 desta seção, "Incorporação", com o modelo. Orientar o embrião bisected para fazer o plano de dissecção virado para a parte inferior do tubo, suavemente empurrando com uma agulha de dissecção maçante-ponta (madeira de manusear a agulha de dissecação).
Feche a tampa e incubar o tubo em um lugar escuro por aproximadamente quatro horas para permitir que o plástico polimerizar.
Faça Technovit mix 3040. Tomar 1 grama do pó a um prato de pesagem, e adicionar 0,5 ml do líquido. Imediatamente, misture o pó e líquido utilizando um bluetip. Despeje em cima do spacimen endurecido. Este Technovit amarelo 3040 irá impedir o bloco inteiro de plástico de sair do tubo.

Seccionamento

Limpe Histoknife H com xileno (EtOH muitas vezes não é bom o suficiente) e configurá-lo em seu micrótomo. Ângulo da lâmina de aproximadamente 45 °. Limpe a área de palco na frente da lâmina com xilol, também, porque a limpeza desta área é fundamental para a qualidade de fatias seccionadas.
Cortar a lateral do tubo e descasque a ponta fora de usar uma faca de papelão.
Definir a amostra no suporte chuck do micrótomo.
Anexar um "press-selar" isolante de silício em um copo de slides para fazer uma câmara de montagem para fatias seção. Pressione firmemente o isolador para o slide na bancada limpa e olhar do outro lado para certificar-se que o isolante é completamente ligado sem-bolhas de ar. Despeje limpa e morna dH ₂ O (~ 40 ° C) para a piscina no slide utilizando uma pipeta Pasteur, até o nível onde ele pode ser visto que a superfície da água torna-se plana, e não côncavo ou convexo em forma.
Comece a fazer fatias seção. Para estudos de imunofluorescência, faço 5 fatias seção mm. Em amostras de hibridização in situ, a espessura das fatias pode ser ajustado na faixa de ~ 3-8 mm, dependendo da finalidade e as intensidades dos sinais.
Realizar as fatias seção do palco na frente da lâmina para a câmara de montagem com água, utilizando um pincel pequeno. Segure o pincel com uma fatia no topo da piscina de água e soltar a fatia para a água batendo-a com uma agulha de dissecção maçante-ponta. A fatia vai expandir em uma forma circular, assim que atinge a superfície da água.
Quando a maioria da área de superfície da água da câmara de montagem é repleta de fatias seção, sugam quase metade da água com uma pipeta Pasteur. Incubar as lâminas em uma noite quente de slides para tornar a amostra completamente seca.
Counter-mancha com 1 ml de DAPI (0.1mg/ml em TE) durante cinco minutos. Aspirar DAPI e secar a amostra.
Remova o isolante de borracha de silicone do slide. Agora podem ser tiradas da amostra. Conservar a amostra a 4 ° C, protegido da luz.

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Buffer			1 L recipe: 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.68 g Na₂HPO₄·7H₂O 0.2 g KH₂PO₄The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1 L. Autoclave.
PBT	Buffer			Add 0.5 mLl of Triton X-100 and 1.0 g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2 mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative	Reagent			Mix 40 mL of methanol and 10 mL of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS	Reagent			Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Ab	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit	Reagent	Vector Laboratories	SA-1200	Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT	Buffer			This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush	Tool
Dull-tip dissection needle	Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040	Reagent		7100 GMA , 3040	glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H	Tool	Energy Beam Sciences	H1310
75% MeOH/H₂O	Buffer
50% MeOH/PBS	Buffer
25% MeOH/PBS	Buffer
30% EtOH/H₂2O	Buffer
50% EtOH/H₂O	Buffer
75% EtOH/H₂O	Buffer
100% EtOH	Buffer
Small glass scintillation vials	Tool	Fisher Scientific	03-339-25B
0.5 mL Thin-wall PCR tubes	Tool	Molecular BioProducts	3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators	Tool	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm L x 19 mm W, 2.5 mm D
Thin razor blade	Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.