Linearização do Ensaio de Proteína Bradford

Summary

A precisão e sensibilidade da determinação de proteína pelo ensaio Bradford rápida e conveniente é comprometida pela não-linearidade intrínseca. Nós mostramos um procedimento de linearização simples que aumenta a precisão, melhora a sensibilidade do ensaio cerca de 10 vezes, e reduz significativamente a interferência por detergentes.

Abstract

Determinação das quantidades microgramas de proteína no ensaio Bradford Coomassie azul brilhante é realizado pela medição da absorbância a 590 nm. Este ensaio mais comum permite a quantificação de proteínas rápidas e simples em lisados ​​celulares, frações celulares, ou amostras de proteínas recombinantes, com a finalidade de normalização das dosagens bioquímicas. No entanto, uma não-linearidade intrínseca compromete a sensibilidade e precisão deste método. É mostrado que, sob condições de ensaio padrão, a relação entre as medidas de absorbância a 590 nm e 450 nm é estritamente linear com a concentração de proteína. Este simples procedimento aumenta a precisão e melhora a sensibilidade do ensaio cerca de 10 vezes quantificação, permitindo até 50 ng de albumina bovina. Além disso, a interferência comumente introduzidas por detergentes que são utilizados para criar a lisados ​​celulares é muito reduzida pelo novo protocolo. Uma equação linear desenvolvido com base em ação de massa e lei de Beer se encaixa perfeitamente os dados experimentais.

Protocol

Linearização da curva de calibração Protein Bradford:

O ensaio de proteína Coomassie azul brilhante, vulgarmente conhecido como o ensaio de Bradford ^1, é amplamente utilizado devido ao seu protocolo rápida e conveniente, bem como a sua sensibilidade relativa. Infelizmente, não há um grande grau de curvatura sobre uma ampla gama de concentrações de proteína (Fig. 1). Portanto, somente uma estreita faixa de concentrações de proteína relativamente alto, 2-10 mg / ml BSA, é usado para o gráfico de calibração, que então se encaixa melhor regressão linear (Fig. 1, verde). No entanto, a não-linearidade exige concentração de proteína das amostras desconhecidas para cair dentro da faixa limitada do gráfico de calibração, a fim de evitar um grande erro, e também reduz a precisão dentro da faixa limitada. A não-linearidade apresenta um sério problema em particular quando as quantias microgramas de proteínas não estão disponíveis, e que muitas vezes requer várias diluições das amostras desconhecidas.

Como observado no papel Bradford original, "a fonte da não-linearidade é o reagente em si uma vez que há uma sobreposição no espectro das duas formas de cores diferentes do corante." ^1. Na verdade, três formas de o corante Coomassie azul brilhante estão em equilíbrio ácido-base no pH ácido usual do ensaio ^2. Os formulários de vermelho, azul e verde têm absorbância maxima de 470, 590 e 650 nm, respectivamente (Fig. 2). O azul é a forma que se liga a proteínas, formando um complexo que absorve a luz intensa em 594 nm ^{3, 4} (Fig. 2). Bradford também observou que "o valor de fundo para o reagente está continuamente diminuindo à medida que mais corante é ligada à proteína" ¹ (Fig. 3). Portanto, buscou-se calcular a redução do fundo nm 590 como quantidades de proteína crescente são adicionados, medindo a variação de absorvância a 450 nm, onde o complexo proteína-corante não absorve. Nós descobrimos que o fundo diminuindo parcialmente, mas não totalmente, as contas para a não-linearidade (Fig. 4).

Em seguida, a hipótese de que a diminuição da concentração de corante livre produz outra distorção da resposta linear, porque como proteínas dye-binding está em equilíbrio ^5, a formação do complexo não depende apenas da concentração da proteína livre, mas também na da tintura livre (Fig. 5). Tendo em conta as questões relacionadas com a concentração variável do corante livre, nós desenvolvemos uma equação matemática que descreve uma relação linear entre a concentração de proteína ea relação de medidas de absorbância, 590 nm mais de 450 nm (Fig. 6). Uma descrição detalhada do estudo teórico e experimental podem ser encontrados em nossa publicação de 1996, em Analytical Biochemistry ^6. A equação matemática foi experimentalmente testado e está a produzir uma curva de calibração linear em toda a faixa concentrações de proteína (Fig. 7). Além disso, a equação foi validada também por uma determinação independente do valor do pH-dependente correta da interceptação do eixo Y ^6.

Protocolo detalhado para o ensaio Melhor Proteína Bradford, utilizando um leitor de Absorbância Microplaca:

1. Prepare uma solução estoque 0,1 mg / ml do padrão, albumina de soro bovino. Qualquer outra norma pode ser escolhido, mas note que o mesmo padrão deve ser utilizado em todos os experimentos.
2. Diluir as amostras desconhecidas em água deionizada. Objetivo de 50-50 mcg / ml. No entanto, as concentrações de proteína maior ou menor são aceitáveis, já que não há limite aparente para o intervalo linear do ensaio. No entanto, a medição deve estar dentro da faixa linear do leitor absorbância.
3. Diluir o reagente de Bradford (Bio-Rad) de 2,5 vezes em água deionizada.
4. Adicionar 0 e 10-50 mL de solução estoque de BSA poços triplicado (criação de uma curva de calibração 0-5 mg BSA). Complementar com água deionizada para alcançar 100 l / poço.
5. Em poços diferentes, adicione 100 ml da amostra desconhecida em triplicatas. Várias concentrações da amostra desconhecida pode ser usado para aumentar a precisão.
6. Adicionar 100 ul do reagente de Bradford diluído para todos os poços. Volume total é de 200 mL / poço.
7. Espere pelo menos 5 min, mas não mais de 60 min para o desenvolvimento de cor.
8. O branco deve ser de 200 mL de água deionizada (e não o corante de proteínas de zero também).
9. Medir a absorvância a 590 nm e 450 nm.
10. Prepare uma curva de calibração, dividindo os valores de absorbância líquida a 590 nm e 450 nm. Note-se que a proteína zero (corante apenas) o valor deve ser incluído como um ponto de dados (Fig. 8).
11. Calcular a concentração da amostra desconhecida com base na equação linear da curva de calibração (Fig. 9).

Resultados representativos:

Ao contrário da absorvância a um único comprimento de onda de 590 nm, a proporção de valores de absorbância, 590 nm mais de 450 nm, é linear wconcentração de proteína i (Fig. 10).

A concentração de proteína da amostra desconhecida pode ser simplesmente calculado usando a equação linear da curva de calibração (Fig. 10, a equação).

No entanto, uma maior precisão é obtida através da medição várias diluições de amostras desconhecidas. Para este efeito, prepare dois gráficos. O primeiro é um gráfico de calibração para o padrão com proteína mg no eixo X (Fig. 11, direita). O segundo gráfico é para a amostra desconhecida, com mL da amostra original não diluído no eixo X (Fig. 11, à esquerda). O valor da tintura só devem ser incluídos em ambos os gráficos (Fig. 11). A concentração de proteína da amostra desconhecida é derivado dividindo as pistas da amostra desconhecida e do padrão (Fig. 11, a equação).

Figura 1. Gráfico de calibração convencional Bradford. A faixa linear é representado por símbolos verdes.

Figura 2. Spectra do complexo proteína-corante e do corante sozinho.

Figura 3. Protein equilíbrio dye.

Figura 4. Redução do fundo correta calculada diminui parcialmente não-linearidade.

Figura 5. Protein dye-equilíbrio.

Figura 6. Base matemática para a linearização do ensaio de proteína Bradford.

Figura 7. Linearização da curva de calibração Bradford.

Figura 8. Cálculo dos valores de absorbância relação.

Figura 9. A curva de calibração linear Bradford.

Figura 10. Linearização da curva de calibração Bradford.

Figura 11. Cálculo da amostra concentração Desconhecido.

Discussion

O ensaio de proteína Bradford é popular devido à sua facilidade de desempenho e de sensibilidade relativa. A linearização sobre as concentrações de proteína toda a gama obtidos pelo protocolo aqui apresentado simplifica ainda mais o ensaio, como amostras desconhecidas não precisa estar dentro do intervalo da curva de calibração.

Importante, o protocolo prevê ainda melhorou as seguintes vantagens sobre o original Bradford protocolo:

1. Maior precisão.
2. A sensibilidade é aumentada em aproximadamente uma ordem de grandeza, tornando-se possível determinar tão pouco como 50 ng BSA no ensaio de microplaca ^6.
3. A sensibilidade melhorada permite a quantificação de proteínas na presença de detergentes. Com o original Bradford protocolo, a interferência através de detergentes normalmente utilizado para a lise celular, muitas vezes resultar em uma diminuição da resposta a proteína. A melhoria da sensibilidade de uma ordem de magnitude permite a diluição das amostras até um ponto onde a interferência através de detergentes é eliminado. Por favor, note que as amostras padrão devem conter a composição detergente mesmo e concentração como nas amostras diluídas desconhecido.

Os picos de absorbância do complexo proteína-corante ea forma livre de corantes vermelhos estão em 594 e 470 nm, respectivamente. Recomenda-se a medir a absorvância a 590-600 nm, para atingir a sensibilidade máxima de alterar a concentração de proteína, e em 450-485 nm, para garantir a linearização.

Devido à consideração do percurso óptico comprimento, maior precisão pode ser alcançada em um ensaio de 1 ml, onde cubetas são colocados em um espectrofotômetro regular, ao invés de um leitor de microplacas. Nesse caso, scale-up os volumes 5 vezes.

É absolutamente obrigatório que a água deionizada será usada como branco. A curva de calibração linear não pode ser obtida se o zero proteínas da amostra contendo padrão do corante é usado como branco.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bradford reagent	Bio-Rad	500-0006
Bovine Serum Albumin	Amersco	0332
Multiplate absorbance reader	BioTek	Synergy2