A precisão e sensibilidade da determinação de proteína pelo ensaio Bradford rápida e conveniente é comprometida pela não-linearidade intrínseca. Nós mostramos um procedimento de linearização simples que aumenta a precisão, melhora a sensibilidade do ensaio cerca de 10 vezes, e reduz significativamente a interferência por detergentes.
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Artigo de método
Linearização do Ensaio de Proteína Bradford
Neste artigo
Resumo
Resumo
Determinação das quantidades microgramas de proteína no ensaio Bradford Coomassie azul brilhante é realizado pela medição da absorbância a 590 nm. Este ensaio mais comum permite a quantificação de proteínas rápidas e simples em lisados celulares, frações celulares, ou amostras de proteínas recombinantes, com a finalidade de normalização das dosagens bioquímicas. No entanto, uma não-linearidade intrínseca compromete a sensibilidade e precisão deste método. É mostrado que, sob condições de ensaio padrão, a relação entre as medidas de absorbância a 590 nm e 450 nm é estritamente linear com a concentração de proteína. Este simples procedimento aumenta a precisão e melhora a sensibilidade do ensaio cerca de 10 vezes quantificação, permitindo até 50 ng de albumina bovina. Além disso, a interferência comumente introduzidas por detergentes que são utilizados para criar a lisados celulares é muito reduzida pelo novo protocolo. Uma equação linear desenvolvido com base em ação de massa e lei de Beer se encaixa perfeitamente os dados experimentais.
Protocolo
Linearização da curva de calibração Protein Bradford:
O ensaio de proteína Coomassie azul brilhante, vulgarmente conhecido como o ensaio de Bradford 1, é amplamente utilizado devido ao seu protocolo rápida e conveniente, bem como a sua sensibilidade relativa. Infelizmente, não há um grande grau de curvatura sobre uma ampla gama de concentrações de proteína (Fig. 1). Portanto, somente uma estreita faixa de concentrações de proteína relativamente alto, 2-10 mg / ml BSA, é usado para o gráfico de calibração, que então se encaixa melhor regressão linear (Fig. 1, verde). No entanto, a não-linearidade exige concentração de proteína das....
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Discussão
O ensaio de proteína Bradford é popular devido à sua facilidade de desempenho e de sensibilidade relativa. A linearização sobre as concentrações de proteína toda a gama obtidos pelo protocolo aqui apresentado simplifica ainda mais o ensaio, como amostras desconhecidas não precisa estar dentro do intervalo da curva de calibração.
Importante, o protocolo prevê ainda melhorou as seguintes vantagens sobre o original Bradford protocolo:
- Maior precisão.
- A sensibilidade é aum.......
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Agradecimentos
Este artigo é dedicado à memória do falecido Dr. Zvi Selinger, que sediou a pesquisa original descreveu aqui.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente de Bradford | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Albumina Sérica Bovina | Amersco | 0332 | |
| Leitor de absorbância multibem | BioTek | Synergy2 |
Referências
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G.
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Reimpressões e permissões
