Summary
हम embryogenesis दौरान रहते इमेजिंग सेलुलर व्यवहार के लिए प्रोटोकॉल chimeric zebrafish भ्रूण उत्पन्न प्रदर्शित करता है.
Abstract
कक्ष embryogenesis दौरान उनके स्थान और संपत्ति में बड़े पैमाने बदल जाते हैं. ये परिवर्तन कोशिकाओं और अपने वातावरण के बीच बातचीत द्वारा विनियमित रहे हैं. Chimeric भ्रूण है, जो अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि की कोशिकाओं से बना रहे हैं महान उपकरण के लिए ब्याज की जीन द्वारा मध्यस्थता सेल सेल बातचीत का अध्ययन कर रहे हैं. zebrafish के प्रारंभिक विकास चरणों में भ्रूण पारदर्शिता सेलुलर स्तर पर ऊतकों और अंगों के morphogenesis के प्रत्यक्ष दृश्य परमिट. यहाँ, हम एक chimeric zebrafish भ्रूण में retinas और दिमाग को उत्पन्न और दाता कोशिकाओं के रहते इमेजिंग प्रदर्शन प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है. प्रत्यारोपण सुई, का प्रत्यारोपण की तैयारी प्रोटोकॉल शामिल GFP-व्यक्त GFP-नकारात्मक मेजबान दाता blastomeres और दाता जीना confocal माइक्रोस्कोपी के अंतर्गत सेल व्यवहार की परीक्षा. मामूली संशोधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल भी zebrafish में अन्य ऊतकों और अंगों के भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लेबल दाता कोशिकाओं को GFP का उपयोग करने के फायदे भी चर्चा कर रहे हैं.
Protocol
दिवस 1. तैयार
1. मछली पार सेट
शाम में zebrafish के जोड़ो पार सेट. वांछित समय से पहले यादृच्छिक संभोग को रोकने के लिए, डिवाइडर का उपयोग करने के लिए संभोग कैसेट में महिला और पुरुष मछली अलग. GFP-व्यक्त ट्रांसजेनिक मछली दाता blastomeres के एक स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है. pt104 ट्रांसजेनिक लाइन (Zou एट अल., 2008), यहां इस्तेमाल किया, GFP सर्वत्र व्यक्त EF1 प्रमोटर के नियंत्रण के अधीन है . GFP अभिव्यक्ति रहते इमेजिंग द्वारा दाता कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देता है. अन्य ट्रांसजेनिक मछली लाइनों है कि उपयुक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त विशिष्ट जरूरतों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
2. भ्रूण होल्डिंग के लिए पच्चर के आकार agarose कुओं तैयार
पिघल 1% agarose, E3 अंडे पानी (Westerfield 2007) में तैयार, एक पेट्री डिश में डालो. कि agarose समाधान पर पच्चर के आकार protrusions है और agarose समाधान जमना पूरी तरह से एक प्लास्टिक मोल्ड फ्लोट. मोल्ड ध्यान से निकालें और E3 के पानी के साथ agarose बिस्तर विसर्जित.
3. प्रत्यारोपण सुइयों तैयार
11.5 सेटिंग गिलास केशिका pipettes (विश्व परिशुद्धता उपकरण) खींच कर सुइयों बनाने के सत्ता में एक ऊर्ध्वाधर सुई खींचने (डेविड KOPF उपकरण) का उपयोग करें. अच्छा सुई युक्तियाँ लंबे शाफ्ट के साथ शंकु चाहिए. भीतरी व्यास में 40 45μm के beveled उद्घाटन कर रहे हैं प्राप्त (छवि 1A) जब तक एक माइक्रो चक्की (Marishige) के साथ एक 45 डिग्री के कोण पर सुई सुझावों पीस. सुई सुझावों को साफ करने के लिए, सुई की कुंद अंत करने के लिए एक नली देते हैं, एक सिरिंज नली कनेक्ट, और फिर चूसना और एक 10% Hydrofluoric एसिड समाधान जारी जब तक सभी दृश्यमान मलबा हटा दिया जाता है. अगला, आसुत जल के साथ टिप्स, 100% इथेनॉल के बाद धो लो. सभी इथेनॉल evaporates जब तक सुइयों वायु - सूखी. यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सुझावों को पूरी तरह से सूख रहे हैं: अवशिष्ट इथेनॉल उच्च तापमान चमकाने चरण के दौरान सुई को बर्बाद कर देगा है. सुई सुझावों के किसी न किसी किनारों को नरम और पॉलिश करने के लिए, एक माइक्रो जालसाज (Marishige) के फिलामेंट से उत्पन्न गर्मी के साथ सुई युक्तियाँ सेंकना. सुई सुझावों को चमकाने के दौरान फिलामेंट स्पर्श मत करो. और फिलामेंट और सुई सुझावों के बीच दूरी और फिलामेंट हालांकि गुजर बिजली की राशि के लिए वांछित हीटिंग शर्तों को पाने के लिए समायोजित किया जा सकता है. तापमान बहुत अधिक नहीं होना चाहिए: इस पिघल और सुई सुझावों ख़राब. के बाद किसी न किसी किनारों smoothened रहे हैं, ध्यान से सुई टिप के साथ गरम फिलामेंट को छूने और फिर धीरे फिलामेंट सुई से दूर करने के लिए एक उठाई अंत (छवि 1B) उत्पन्न खींच. एक तेज, चिकनी, और स्वच्छ सुई बरकरार दाता blastomeres प्राप्त करने के लिए और हानिकारक मेजबान भ्रूण नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है.
4. एक जांच भ्रूण स्थिति तैयार
एक गैस लौ पर एक गिलास विंदुक खींचो एक smoothened अंत के साथ ठीक एक गिलास जांच प्राप्त करने के लिए. यह जांच पहले प्रत्यारोपण उचित ओरिएंटेशन में भ्रूण की स्थिति के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
2 दिन. Blastomere प्रत्यारोपण
1. लीजिए और dechorionate भ्रूण
अगले दिन, पार कैसेट में डिवाइडर हटाने दोस्त के लिए मछली की अनुमति. भ्रूण E3 के पानी से भरा एक पेट्री डिश में रखें. फिर, मैन्युअल दूर ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ भ्रूण से chorions फाड़ dechorionate भ्रूण. तुला शाफ्ट के साथ एक गिलास विंदुक का प्रयोग करें ध्यान agarose कुओं में dechorionated भ्रूण स्थानांतरण. हवा के साथ भ्रूण के किसी भी संपर्क से बचें, जो फट करने के लिए भ्रूण के कारण. भ्रूण 28.5 पर विकसित ° agarose कुओं में सी 3 घंटे के बाद, निषेचन, या HPF तक.
2. एक प्रत्यारोपण तंत्र सेट
जबकि भ्रूण विकास, खनिज तेल भरा सूक्ष्म पम्पिंग प्रणाली के लिए प्रत्यारोपण सुई को जोड़ने के द्वारा एक प्रत्यारोपण तंत्र सेट. सुनिश्चित करें कि प्रणाली रिसाव नहीं करता और कोई हवाई बुलबुले प्रणाली में फंस रहे हैं. खनिज तेल के साथ पूरे प्रत्यारोपण सुई वापस भरने, 0.5 के लिए छोड़कर - टिप उद्घाटन के अवसर पर अंतरिक्ष की एक μl.
3. Blastomeres के ट्रांसप्लांटेशन
Blastomeres प्रत्यारोपण करने के लिए, एक कांच पोजीशनिंग जांच का उपयोग करने के लिए 3 4 HPF भ्रूण के blastomere ओर ऊपर की तरफ मालूम. फिर, धीरे से एक दाता भ्रूण में प्रत्यारोपण सुई डालने और धीरे धीरे सुई में 5-20 blastomeres चूसना. Blastomere भरा एक मेजबान भ्रूण में सुई डालें और blastomeres धीरे रिलीज. साइट पर जो blastomeres जारी कर रहे हैं जहां उनके वंशज बाद में विकास के चरणों में स्थानीयकरण प्रभावित करेगा. रेटिना और मस्तिष्क के विकास, पशु पोल पर रिहाई कोशिकाओं का विश्लेषण. प्रत्यारोपण के दौरान, सुनिश्चित करें कि सुई टिप हवा से संपर्क नहीं करता है. यांत्रिक नुकसान को कम करने के लिए, मेजबान भ्रूण 28.5 ° C पर agarose कुओं में किया जाएगा अगले दिन जब तक छोड़ दिया. फिर टी,24 अच्छी तरह से पूर्व 1% agarose के 0.5 मिलीलीटर के साथ लेपित प्लेटों के मोज़ेक भ्रूण प्रत्येक कुएं में एक भ्रूण के साथ ransfer. E3 अंडे पानी के 1 मिलीलीटर प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा जाता है. जीवाणु संक्रमण को रोकने के लिए, 100X पेनिसिलिन और E3 अंडे पानी के लिए स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10 μl जोड़ें.
3 दिन. एम्बेडिंग और मोज़ेक भ्रूण के रहते इमेजिंग
1. एम्बेड भ्रूण
E3 अंडे पानी में 1.5% कम पिघलने बिंदु agarose (LMP) तैयार है और एक 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में समाधान रखना. 0.17mm मोटाई में गिलास नीचे के साथ एक FluoroDish टिशू कल्चर पकवान (विश्व परिशुद्धता उपकरण) के लिए एक मोज़ेक भ्रूण स्थानांतरण. बस E3 की एक न्यूनतम राशि के द्वारा कवर भ्रूण छोड़ अतिरिक्त E3 पानी निकालें. भ्रूण 30-50 μl पिघला 1.5% एलएमपी जोड़ें. जल्दी आँख या मस्तिष्क के रूप में संभव के रूप में गिलास नीचे के करीब agarose समाधान solidifies से पहले की स्थिति. बाद समाधान नीचे ठंडा, अतिरिक्त agarose समाधान को जोड़ने के लिए आगे जगह में भ्रूण को सुरक्षित. फिर, 2-3 मिलीलीटर E3 अंडे पानी के साथ जम agarose ब्लॉक विसर्जित कर दिया.
2. Confocal इमेजिंग
Confocal माइक्रोस्कोपी के लिए, एक पानी विसर्जन बड़े ध्यान गहराई के साथ उल्टे उद्देश्य (ओलिंप, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, जापान) प्रयोग किया जाता है. पानी की एक बूंद के उद्देश्य पर जोड़ा है और तब उद्देश्य पर एक FluoroDish टिशू कल्चर पकवान जगह. छवि विकास करने के लिए, हर 5 मिनट के भ्रूण के चित्र लेने के द्वारा समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन. प्रयोगों की प्रकृति पर निर्भर करता है, शॉट्स के बीच समय अंतराल को समायोजित किया जाना चाहिए.
प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 2 एक 24-HPF मोज़ेक zebrafish प्रतिनिधि दिखाता है. GFP अभिव्यक्ति हरे रंग में दाता कोशिकाओं पर प्रकाश डाला गया. रेटिना neuroepithelial कोशिकाओं रेटिना दीवार की पूरी मोटाई अवधि.
फिल्म 24 HPF पर मेजबान मस्तिष्क में दाता कोशिकाओं के आंदोलनों से पता चलता है है. सूचना कोशिकाओं morphologies समय के साथ बदल जाते हैं.
चित्रा 1 प्रत्यारोपण सुई सुझावों की आकृतियाँ. ए एक सुई की नोक के beveled खोलने Hydrofluoric एसिड washes के बाद मलबे से मुक्त था. एक उठाई अंत बी सुई नोक पर उत्पन्न किया गया था.
चित्रा 2 विज़ुअलाइज़ेशन. GFP-24 HPF पर एक chimeric zebrafish भ्रूण में दाता कोशिकाओं व्यक्त. बाईं पैनल मस्तिष्क और रेटिना में GFP संकेतों से पता चलता है. मध्यम पैनल भ्रूण के एक चमकदार क्षेत्र की तस्वीर है. सही पैनल मर्ज किए गए छवि दिखाता है.
मूवी 1. लाइव इमेजिंग GFP सकारात्मक दाता कोशिकाओं के विकास के दौरान मस्तिष्क neuroepithelial कोशिकाओं के morphologies में व्यापक परिवर्तन का प्रदर्शन . फिल्म के अलग - अलग फ्रेम हर 5 मिनट 24 और 25 HPF के बीच एकत्र किए गए थे. लिए यहाँ क्लिक करें फिल्म देखने.
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Discussion
इस वीडियो में, हम blastomere प्रत्यारोपण के लिए एक विधि zebrafish में रेटिना और मस्तिष्क के विकास का विश्लेषण प्रदर्शित करता है. इस प्रोटोकॉल भी बस मेजबान भ्रूण में इसी स्थानों के लिए दाता blastomeres जारी करके अन्य ऊतकों और अंगों के विकास का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. GFP अणुओं के साथ लेबलिंग फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित Dextran (हो और केन 1990) के साथ लेबलिंग की तुलना में एक क्लीनर पृष्ठभूमि पैदावार. यह है क्योंकि मृत दाता कोशिकाओं से Dextran रंगों के मलबे बहुत GFP की तुलना में अब तक रहता है, इस प्रकार इमेजिंग (Catalano एट अल, 2007) के साथ inferring. इसके अलावा, GFP सकारात्मक दाता कोशिकाओं Dextran रंगों वाले लोगों की अपेक्षा ज्यादा स्वस्थ होते हैं.
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Acknowledgments
एनआईएच R01EY016099 अनुदान और अनुसंधान के लिए रोकें दृष्टिहीनता कैरियर विकास पुरस्कार: इस अध्ययन में एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) कोर अनुदान (5P30EY008098) और निम्नलिखित धन XW द्वारा समर्थित किया गया. हम Kira लेथरोप confocal इमेजिंग में सहायता के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ¾" Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| FluoroDish | World Precision Instruments, Inc. | FD35 | |
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | |
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | |
| Manual Microsyringe Pump | World Precision Instruments, Inc. | MMP | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | |
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | |
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Agarose | Research Products International Corp. | 9012-36-6 | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
E3 egg water:
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References
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
