Summary
이 동영상은 흰개미의 hindgut에 거주 미생물의 종 DNA를 추출하기위한 기술을 보여줍니다. 굿 미생물 커뮤니티를 시각화하는 데 유용합니다 젖은 마운트 슬라이드의 준비도 그림이고, 종의 풍부한 굿 환경을 통해 투어가 주어집니다.
Abstract
흰개미는 나무 소비에 의해서만 존속 수있는 능력을 가지고 알려진 몇몇 동물들이다. 흰개미 창자의 넓이는 주로 아세테이트로 lignocellulose의 저하에 도움을 밀도와 종의 풍부한 미생물 인구를 포함, 흰개미의 신진 대사에 연료를 주요 영양소 (Odelson & Breznak, 1983). 이러한 미생물의 집단 내에서 일부 ( "낮은") 흰개미에 진핵세포는 원생 동물문 박테리아, methanogenic archaea하고입니다. 따라서 흰개미 우수한 연구 과목은 미생물의 종류와 그들의 호스트의 혜택을 수행할 수많은 생화학 기능 간의 상호 작용을 공부하고 있습니다. 흰개미 창자뿐만 아니라 다양한 생화 학적 과정에 관여 주요 유전자의 미생물 인구의 종 구성은 분자 기술 (., Schmit - 바그너 외, 2003;. Salmassi & 레드 버터, 2003 쿠도 외, 1998)를 사용하여 탐색되었습니다. 이러한 기법은 흰개미 굿 환경에서 고품질 핵산의 추출 및 정제에 따라 달라집니다. . Berthelet 외, 1996,,. 퍼디 외, 1996;. Salmassi & 레드 버터,이 동영상에서 설명한 추출 기술은 환경 샘플 (모 외, 1994에서 핵산의 추출 및 정화용으로 개발된 프로토콜의 수정 편집입니다 2003;. Ottesen 외 2006) 그리고 그것은 효소의 연쇄 반응 (PCR)에 대한 템플릿으로 사용하기에 적합 흰개미의 hindgut 자료에서 DNA를 생성합니다.
Protocol
흰개미 전체 - 직감 DNA 추출을위한 절차 요약 :
- 얼음 얼음 흰개미는 멸균 핀셋을 사용하여 용기를 제거하고 버퍼에 굿 샘플을 안정화.
- PVPP / SDS / 페놀 버퍼에 샘플을 균질.
- Qiagen DNeasy 컬럼을 사용하여 원유 lysate에서 DNA를 추출하고 정화.
프로토콜 :
- 얼음, 살균 집게를 사용하여 노동자 계급의 흰개미의 내장을 제거하십시오.
- 즉시 50 μL 얼음처럼 차가운 1X 분자 생물학 성적 TE 버퍼를 포함하는 멸균, nuclease없는 튜브에 창자와 내용을 전송 (1 MM 트리스 - HCL, 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0). -20 ° C에서 샘플을 고정하거나, 균질와 직접 진행합니다.
- 멸균, nuclease없는 두 ML 나사 뒤덮힌 튜브로 굿 샘플 버퍼를 전송 미리 로드된 1퍼센트 W / V polyvinylpolypyrrolidone (PVPP를 포함하는 멸균 지르코니아 / 실리카 구슬 (0.1 mm) 및 1X TE 버퍼 700 μl 500 MG와 ).
- 20 % 나트륨 dodecyl 황산 (SDS) 50 μl와 샘플에 페놀 500 μl를 추가합니다.
- 30 초의 균질 세 사이클 얼음에 냉각 30 초를 사용하여 최상의 설정 (비즈 비트) 균질.
- 8,000 X g에서 1 분 세디먼트 불용성 물질.
- 원유 lysate 정화에 대해 설명한 방법을 사용 Qiagen DNeasy 컬럼과 수성 (맨 위에) 계층의 300 μl aliquots 정화.
- 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에서 핵산 내용 및 동결 샘플을 계량.
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Discussion
우리의 경험에서 Zootermopis의 nevadensis 같은 나무 먹이를 흰개미 종의 미생물 지역 사회에서 추출한 DNA는 추출과 정화의 한 라운드 후 PCR 템플릿에 대해 충분히 순수합니다. 그러나, 쓰레기 수유 및 토양 수유 종 같은 일부 흰개미들은 굿 내용에 humic 지방산의 높은 농도를 수 있고 굿 미생물 DNA의 추가 정화를 필요로 할 수 있습니다. 5 Z.의 nevadensis 근로자의 내장에서 총 DNA 수율은 10-30 μg의 범위에 있습니다. 크게 작게 또는이 종이보다 큰 흰개미 종 들어, 더 많거나 적게 표본은 DNA의 비슷한 금액을 얻기 위해 필요한 수 있습니다.
이 방법은 쉽게 RNA 추출을 허용하도록 적용할 수 있습니다. RNA 추출은 프로토콜의 2 단계에서 설명한 얼음처럼 차가운 TE 버퍼에 대한 Qiagen (catlog 안돼. 76506)에서 1X RNAprotect의 박테리아 시약을 대체합니다. Qiagen RNeasy의 시약과 열이 (없습니다. 74,104을 catlog 없음) 위에서 설명한 DNeasy 정화 절차 대신 사용해야합니다. DNA는 RNAprotect - 안정화 샘플에서 정화와 약 단 300 μL 수 있듯이. 7 단계에서 가져온 700 μL 수성 층은 핵산 정화를 위해,이 방법은 하나의 샘플에서 병렬로 DNA와 RNA를 모두 검색하는 데 사용할 수 있어야합니다.
이러한 기법은 흰개미 굿 환경에서 고품질 핵산의 추출 및 정제에 따라 달라집니다. . Berthelet 외, 1996,,. 퍼디 외, 1996;. Salmassi & 레드 버터,이 동영상에서 설명한 추출 기술은 환경 샘플 (더 외, 1994에서 핵산의 추출 및 정화용으로 개발된 프로토콜의 수정 편집입니다 2003;. Ottesen 외 2006) 그리고 그것은 효소의 연쇄 반응 (PCR)에 대한 템플릿으로 사용하기에 적합 흰개미의 hindgut 자료에서 DNA를 생성합니다.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PVPP/SDS/phenol | Buffer | homogeneization buffer | ||
| DNeasy Tissue Kit | Kit | Qiagen | 77607 | Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003) |
| TE | Buffer | Sigma-Aldrich | T9285 | 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate |
| zirconia/silica beads | Supplies | Biospec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | Reagent | Sigma-Aldrich | P6755 | 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer |
| Zootermopsis nevadensis | Animal | Termites | ||
| SDS | Reagent | Sigma-Aldrich | L4390 | Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent |
| Phenol | Reagent | Sigma-Aldrich | 77607 | TE-saturated, ~73% |
| MiniBeadbeater-8 | Tool | Biospec Products | 963 | |
| BSS | Buffered Salt Solution, pH 7.2 | Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1 M soln. of NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination |
References
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
