In vivo Centrifugering av Drosophila embryon

Summary

Vi beskriver en metod att separera organeller av täthet i levande

Abstract

En viktig strategi för rening och isolering av olika typer av intracellulära organeller är att skilja dem från varandra som bygger på skillnader i stigande densitet. Men när celler störs före centrifugering, proteiner och organeller i denna främmande miljö ofta olämpligt hålla sig till varandra. Här beskriver vi en metod att separera organeller av täthet i intakta, levande Drosophila embryon. Tidiga embryon innan cellularization skördas från befolkningen burar, och deras yttre äggskal avlägsnas genom behandling med 50% blekmedel. Embryon överförs sedan till en liten agarplatta och införas bakändan först i små vertikala hål i agar. Plattorna innehåller inbäddade embryon centrifugeras i 30 min vid 3000g. Den agar stöder embryon och håller dem i en definierad inriktning. Efteråt är de embryon grävt ur agar med en trubbig nål.

Centrifugering separerar stora organeller i olika lager, en skiktning väl synlig med ljus-fält mikroskop. Ett antal fluorescerande markörer finns för att bekräfta lyckad skiktning i levande embryon. Proteiner är förknippade med vissa organeller kommer att berikas på ett visst lager, vilket visar colocalization. Individuella lager kan återvinnas för biokemisk analys eller transplantation till givare ägg. Denna teknik är tillämpligt för organell separation i andra stora celler, inklusive ägg och ägg av olika arter.

Protocol

1) Förberedelse agarplattor

Översikt: Detta protokoll använder agarplattor för två olika användningsområden. För det första agarplattor fungera som insamling av ägg ytan, äppeljuice i agarn stimulerar äggläggningen. För det andra är embryon inbäddade i agar hålls i ett fast orientering när plattorna är centrifugeras, en tillräckligt hög koncentration av agar är nödvändig för att förhindra att plattorna från sönderfallande under centrifugering. För enkelhetens skull, är en enda typ av äppeljuice agar används för båda användningsområden.

Material

• Agar (25 g)
• Sackaros (25 g)
• Äppeljuice (250 ml)
• Nipagin M stamlösning (5 g metyl-p-hydroxy-bensoat i 50 ml etanol), fungerar som ett konserveringsmedel
• Petriskålar: för centrifugering (60x15mm) och för insamling av ägg (60x15 mm eller 100x15 mm, beroende på i farten burar som används i steg 2)

Utrustning

• Värmeplatta
• Två E-kolvar

1. I en Erlenmeyerkolv kombinera 25 g agar och 750 ml dH ₂ O. Autoklav 50 min på flytande cykel. Under tiden förbereder äppeljuice lösning (steg 1,2).
2. I en annan Erlenmeyerkolv kombinera 25 g sackaros och 250 ml äppeljuice. Värm på värmeplatta (till ca 55 ° C) för att lösa sackaros. Tillsätt sedan 15 ml Nipagin M lösning. Undvik höga temperaturer, eftersom de kommer att orsaka Nipagin att bryta ner.
3. När agar lösningen har svalnat tillräckligt för att kolven kan hanteras för hand, kombinera de två lösningarna och blanda väl. Rör på värmeplatta tills den är jämnt blandat.
4. Häll lösningen i petriskålar (~ 0,5 cm hög). 1 liter lösning räcker till cirka 100 små (60 mm diameter) eller 40 stora (100 mm diameter) rätter.
5. Agarplattor ska torka i flera timmar eller över natten i rumstemperatur, annars kommer de att bli för blöt för användning. För långtidsförvaring, förvara dem insvept (i plastkärl eller Petri ärmar maträtt) vid 4 ° C.

2) Skörd embryon

Översikt: Under de första 3 timmars utveckling (vid rumstemperatur), Drosophila embryon enstaka celler (inte räkna könsstamceller föregångare, den posteriort placerade stolpen celler). När väl orienterade embryon av dessa stadier är centrifugeras, de stora organeller Åtskilj med täthet längs den långa axeln av ägget. På cellularization skede är detta stora enda cell omvandlas till tusentals små celler, centrifugeringen anställd krafter kommer inte att brista dessa celler. För framgångsrik segregering av stora organeller är det därför viktigt att centrifug embryon som ännu inte har slutfört cellularization.

Material

• Äppeljuice agarplattor
• Jäst klistra in (torrjäst blandas med vatten till jordnöt-smör konsistens)

Utrustning

• Fly burar: kommersiellt tillgängliga (se nedan) eller hemlagad ¹

1. Vuxna flugor hålls i burar som äppeljuice agarplattor fästs längst ner. Använd en storlek på petriskålar lämplig för burar som används.
2. Att initiera en insamling av ägg, förbereda ett äpple tallrik juice agar och täcka en del med jäst pasta. Bananflugor äta jäst, i synnerhet, ger jästen näring för äggproduktion. Förekomsten av jäst och äppeljuice i agarn inducerar också äggläggningen.
3. För att byta det gamla med det nya agarplatta, är flugan buren upp och ned och bankade på bänk ett par gånger. Flugorna kommer att falla till botten och är kortfattat desorienterade. Det ger dig ett par sekunder för att snabbt ta bort en agarplatta och ersätta den med en ny. Detta utbyte tar lite övning och detaljer beror på vilken typ sysselsatt bur.
4. Kvinna flyger lagra spermier från tidigare parningar i intern påsar (spermathecae) ​​från vilken sperma frigörs för att möjliggöra befruktning av ägg. När väl mat och ostört, lägger honorna ägg strax efter befruktningen, och därmed tiden för äggläggning markerar tidpunkten för befruktning och början av utvecklingen. När förhållandena inte är optimala, honorna håller befruktade ägg för rörlig gånger tidigare om. För att minimera antalet sådana mis-iscensatt embryon, är det lämpligt att kasta den första samlingen av arbetsdagen (en "pre-collection" på 30 till 60 minuter räcker). Närvaron av färsk jäst inducerar honorna att lägga dessa hålls ägg, och efterföljande ägg samlingar tenderar att domineras av äggen deponeras strax efter befruktningen.
5. Samla ägg för upp till 3 timmar, beroende på vilken linda önskas. Sedan vid rumstemperatur cellularization slutförs efter ~ 3,5 timmar, längre samling tider är inte användbara. Mest konsekventa skiktning uppnås i unga embryon, så för rutinmässig experiment har vi för kortare samling gånger (1 timeller mindre).
6. Ibland flyger fastnar på jäst eller till ytan på agarplatta. Ta bort dem med pincett.

3) Ta bort ägget skal från embryon

Översikt: Drosophila embryon omfattas av två skyddande skikt: ett yttre lager (chorion) av protein och ett inre skikt (vitelline membran) huvudsakligen gjord av vax. De skyddar fostret mot mekaniska förolämpningar och uttorkning. Den chorion har två förlängningar (ägget trådar eller rygg bihang) som är synliga som skilda strukturer. I detta steg kommer vi att ta bort chorion genom att blötlägga äggen i 50% blekmedel. När chorion tas bort, blir embryot transparent genomlysning, vilket gör valet av specifika embryonala stadier för centrifugering. Som chorion skulle också störa många efter centrifugering förfaranden (t.ex. fixering i steg 6), borttagning av chorion nu kommer att tillåta snabb bearbetning senare.

De 50% blekmedel behandling som löser upp chorion inom några minuter, men det gör inte skada embryot. Den vitelline membranet håller bleka ut. Vi kommer att fortsätta bleka behandling tills ägget filament är inte längre synliga. Efteråt kommer vi att skilja embryon från blekmedel genom att hälla embryot / blekmedel slurry genom en liten sil (en korg gjord av metallnät). Det är viktigt att inte rusa blekmedel exponering steg. Om blekmedel tvättas bort i förtid, senare steg (t ex borttagning av vitelline membranet följande fixering) kan komma att äventyras.

Material:

• Sprutflaska med 50% blekmedel (en volym dH ₂ O till en volym kommersiellt blekmedel)
• Sprutflaska med dH ₂ O
• Pappershandduk

Utrustning:

• Homemade trådkorgar gjord av plåt av rostfritt ståltrådsnät. För att göra korgar, skära rutor av ~ 2 x 2 cm ut från plan plåt och strecksats dem i mitten.
• Pincett för att hålla trådkorgar
• Analysera mikroskop inställd för genomlysning

1. Placera agarplatta under ett dissekera mikroskop och iaktta embryon av genomlysning. Se till att identifiera ägget filament (se Figur 2A).
2. Squirt 50% blekmedel på agarplatta, som omfattar embryon. Skaka agarplatta emellanåt för att snurra embryona runt i blekmedel.
3. När ägget filament är synliga (vanligtvis efter 3-5 minuter, men tiderna kan variera), har chorion tagits bort framgångsrikt.
4. I nästa steg kommer ett trådnät korg användas som sil för att skilja embryon från blekmedel. Ta trådkorg med pincett och håll den över inverterade locket på agarplatta. Locket kommer att fungera som reservoar för att fånga bleka droppar genom trådnät.
5. Häll blekmedel / embryot slam från agarplatta genom trådnät.
6. Om ett stort antal embryon kvar på agarplatta, spruta dH ₂ O på plattan och häll dH ₂ O / embryo slam genom trådnät. Om ett stort antal embryon spilla över i reservoaren, häll reservoaren innehållet genom trådnät.
7. Peka på botten av metallnät med en pappershandduk att sudda bort all överflödig vätska. Sen sprutar dH ₂ O på trådnät för att skölja bort kvarvarande blekmedel. Som beskrivits ovan kan täckplåten användas som reservoar för att återkräva embryon tvättade bort. Du kan minimera förlora embryon genom att rikta strålen med vatten från sprutflaska längs omkretsen av trådkorg. Vanliga blot bort överflödig vätska.
8. Upprepa detta tvättsteg fem till tio gånger, tills alla blekmedel har tagits bort. Om trådkorg fortfarande luktar blekmedel, bör tvätta fortsätta.

4) Montering embryon i agar

Översikt: Drosophila ägg är mycket längre (~ 500 mikrometer) än bred (~ 180 mikrometer). För att få maximal och konsekvent uppdelning av organeller under centrifugering, vi orienterar embryon så att deras främre ändar pekar mot centrum av rotationen (figur 1, 3). På så sätt de lättaste intracellulära strukturer (lipiddropparna) ansamlas i framändan i alla embryon, medan mycket täta strukturer (gula komponenter) ansamlas nära den bakre änden. Embryon in i små vertikala hål i äppeljuice agar, med den främre ändar sticker upp. Den agar håller embryo i ett fast läggning under centrifugering.

Utrustning:

• Nål
• Tungsten nålar, nålar är monterade i hållaren bakåt från den typiska orientering, så att den trubbiga änden sticker ut och är tillgänglig att manipulera embryon
• P200 pipett
• Analysera mikroskop inställd för transillumination
• Fly pensel (liten pensel användas för att sortera vuxna Drosophila)

Material:

• Triton Salt Solution (TSS): 4g NaCl, 0,3 ml Triton X-100, fyll med DDH ₂ O till 1000 ml (kan göras som en 10x stamlösning)

1. Tvätta embryon ur trådkorg med TSS och in i en tom petriskål. Embryona ska sjunka till botten. Överför petriskål innehåller embryon i TSS på en dissekera omfattning och observera med genomlysning (embryon kommer att se liknande de som visas i Figur 4).
2. Med hjälp av en P200 pipett, välj embryon av önskad steg och överföra dem till en liten agarplatta. Vissa stadier lätt att känna igen visuellt (figur 4, för mer information, se ^1). Arbeta snabbt eftersom embryon åldras och långvarig nedsänkning (längre än 30 min) i TSS kan påverka utvecklingen.
3. Ta bort de flesta TSS med en pipett och en Kimwipe. Ytan på agar ska vara lite fuktig vilket gör det lättare att driva embryon runt. Dock bör det inte finnas pooler av vätska kvar någonstans på tallriken eftersom överflödig vätska under centrifugeringen gör att embryon för att glida ur hålen.
4. Med hjälp av en nål, peta vertikala hål i agar nära där ett embryo finns. Det är svårt att peta hål som är helt vertikal för att du måste hålla nålen i en vinkel för att kunna samtidigt titta i mikroskop. En mindre lutning nålen är faktiskt fördelaktigt eftersom det skapar en lätt depression / lund på ena sidan av hålet så att embryot kan lätt glida längs den och in i hålet. Det räcker att punktera ytan av agar sedan agar är mjuk nog att när ett embryo delvis sätts in i ett hål den kan skjutas in ytterligare utan skador.
5. Se till att du känner igen främre och bakre ändar av embryon, som embryon skall föras in hålen i en konsekvent vägledning, vanligtvis med framändan upp. Den vitelline membranet i framändan kännetecknas av en specialiserad struktur, micropyle (figur 2), genom vilken spermierna kommer in under befruktningen.
6. Använda den trubbiga änden av nålen, kan du trycka mot embryot att flytta den längs agar samt att orientera / manövrera sin bakre ände mot en punkterad hål. Tryck sedan in mot den främre änden mot hålet. Detta borde lätt glider embryot i hålet längs liten fördjupning bildas vid punktering. Som embryot lutar uppåt, tryck in den djupare ner i hålet.
7. När helt intryckt, är embryot oftast redan är ganska lodrät. Om inte, kan du justera in embryot mer vertikalt genom att trycka på den i sidled. Om hålet inte är för stor, kommer embryot position stabilt innehas av agar hela centrifugering.
8. Med praktiken är det möjligt att bädda in 100-250 embryon per platta. Det beror på den särskilda ansökan hur många som behövs: Om embryon som används för live-avbildning eller som donatorer för transplantation experiment, finns bara några få krävs. Om embryon skall fastställas och immunostained kommer en bråkdel förlorad under tiden efter centrifugering bearbetning, och man måste börja med högre nummer. Tänk på att embryon fortsätta att utvecklas under montering så om en smal utvecklingsstadiet önskas, till den totala tiden för montering måste hållas kort.
9. Om det finns några embryon överblivna som inte var inbäddad, ta bort dem från plattan med en fuktad fluga borste. Doppa flyger borsten i vätska (t.ex. 1xTSS), torka noggrant över toppen av plattan (medan du tittar under dissekera omfattning) för att sopa upp alla överblivna embryon, och tvätta embryon ur borsten genom att doppa penseln i vätskan igen.

5) Centrifugering och återvinning av embryon

Översikt: Plattorna överförs till svängig hinkar med en Sorvall RT7 Plus centrifug och centrifugeras i 30 min vid 4000 rpm, vilket motsvarar ~ 3000 g. Efter centrifugering är täckta med TSS. Med en nål, är embryon grävde ur hålen i agar och överföras till lämpliga fartyg via en pipett.

Utrustning:

• Nål hållare med nål (som tidigare)
• Sorvall RT7 Plus med RTH750 rotor och svängig hinkar, eller motsvarande ²
• Analysera mikroskop inställd för genomlysning
• P200 pipett

Material:

• TSS

1. Överföring plattorna svänga hinkar av centrifugen, agar nedåt. Se till att centrifugen är jämnt balanserad.
2. Inställningar för centrifugering: Temperatur = 40-10 ° C, min = 4000, tid = 30 min.
3. Efter centrifugering, placera agarplatta under dissekera mikroskop igen och täcka plattan med ett lager av TSS.
4. Använda BLunt slutet av nålen, gräva embryon ur sina hålor. De kommer att flyta i TSS, men kommer att förbli under vatten.
5. Embryon kommer att visas självklart lager, med en brun mössa i framändan, en klar mellersta region, och ett mörkt, grått område på den bakre änden (figur 2, 5A). Släng embryon som inte visar klara skiktning.
6. Med hjälp av en P200 pipett, överföra den väl skiktade embryon i TSS till ett nytt fartyg, t.ex. en scintillation flaska eller mikrocentrifugrör, beroende på applikation.

6) Ytterligare behandling

Beroende på tillämpning, kommer embryon därefter att behandlas på olika sätt.

1. För direkt observation av ljus-fält eller epifluorescence mikroskopi, är embryon i buffert på en glasskiva, och monteras under en 22x22 mm # 1,5 täckglas, med 18x18 mm # 1 täckglas som distanser. För långsiktiga observationer, kan det vara nödvändigt att ersätta bufferten med Halocarbon olja 27.
2. Om embryon skall fastställas, bör de skall överföras i steg 5,6 till en scintillation flaska. De kan sedan fastställas med hjälp av vanliga fixering tekniker ^1. Dessa tekniker använder vanligtvis agitation i en heptan-metanol emulsion för att ta bort vitelline membranet. Observera att för centrifugeras embryon effektiviteten i denna devitellinization steg är låg. Det är därför lämpligt att börja med så många embryon som praktiskt eller att ta bort vitelline membranet manuellt ^1.
3. Om embryona kommer att användas vid transplantation experiment (t.ex. att ta bort en särskild organell lager från centrifugerade embryon) är de överförs till agarplattor och monteras på täckglas, med vanliga rutiner som för uncentrifuged embryon ^3. Den skiktning som induceras av centrifugering är stabil i tiotals minuter.

7) representativa resultat

Om centrifugering fungerade som förväntat, kommer de stora embryonala organeller sortera ut av täthet ^2. Till exempel kommer de med låg densitet lipiddropparna ansamlas i framändan, med hög densitet gula blåsor kommer att ackumuleras i bakändan (figur 1, 2). Lipid droppar och blåsor gulan är lagring organeller för lipider och proteiner.

Bekräftelse av densitet beroende stratifiering uppnås genom visuell inspektion av levande embryon genom genomlysning under en dissekera eller sammansatt mikroskop. Embryona ska visas som i figur 5A: Den lipiddropparna kommer att utgöra en fast brunt skikt i själva främre spetsen (en "lipid cap"), äggula ackumulering kommer att resultera i en mörkgrå zon i bakändan. Dessa två mörka lager skiljs åt av en bred klar zon som representerar andra organeller och cytoplasman. Om embryon centrifugeras efter cellularization kommer skiktning vara minimal (Figur 5C).

Om ett epifluorescensmikroskop finns tillgänglig kan dessa levande, centrifugeras embryon prövas enligt UV-excitation. Under dessa förhållanden, visar äggulan intensivt blå autofluorescens (Figur 5B). En kompakt lager av autofluorescent material vid den bakre stolpen indikerar framgångsrika centrifugering och fungerar som en markör för den bakre änden.

Observera att utseendet på dessa lager kommer att förändras drastiskt om embryona är fasta. Till exempel, när embryona fastställs av standard värme-eller formaldehyd fixering följt av heptan-metanol devitellinization ^1, lipid droppar blir genomskinlig och lipid lagret visas vitaktig och fluffigt av starkt ljus mikroskopi, snarare än mörkbrun (Figur 5D). Äggulan autofluorescens är helt eller delvis förstörts av fixering, och blev mycket mindre intensiv eller tom omöjlig att upptäcka.

Om in vivo centrifugering är anställd för att markera en viss organell är det bra att märka att organell med en fluorescerande markör för bekräftelse. Till exempel YFP fusionsproteiner riktade till mitokondrierna, har ER eller Golgi beskrivits ^4. I centrifugeras embryon, dessa markörer samlas på karaktäristiska positioner längs den främre bakre axeln (figur 1). Slutligen, vissa histon fusionsproteiner lokalisera både lipid droppar och kärnor ^2, och därmed kan användas för att markera dessa cellens (Figur 5 E, F) samt att övervaka skede av embryot (med antalet märkta kärnor) . Fly stammar som uttrycker markörer som nämns i detta stycke är tillgängliga från Bloomington Drosophila beståndet centrum (http://flystocks.bio.indiana.edu/). För histon H2Av, både GFP och mRFP varianter finns ^{5, 6}

Figur 1. Separering av organeller genom centrifugering (modifierad efter ^2). Centrifugering av orienterade embryon resulterar i olika skiktning(Starkt ljus). Stora organeller samlas på karaktäristiska positioner längs den främre (upp) - bakre (ner) axel: lipiddropparna (upptäcks i fasta embryon genom Nilen röd missfärgning), endoplasmatiska retiklet, Golgi och mitokondrier (upptäcks i levande embryon via YFP markörer som beskrivs i huvudtexten), äggula (som påvisas med autofluorescens). Fluorescensen bilder förvärvades av konfokalmikroskopi.

Figur 2. Schematisk bild av embryon.

A. ägg med äggskal och framstående filament ägg (dorsala bihang). Som äggskalet inte är genomskinlig, visas ägget jämnt mörkt.

B. ägg med chorion bort. I framändan (vänster) är micropyle synlig. Beroende på utvecklingsstadiet kommer embryot inne i vitelline membranet är jämnt mörkbrun eller visa olika strukturer. Se Figure4 för exempel.

C. centrifugeras embryo, orienterade som i det protokoll som beskrivs här. Lipiddropparna ackumuleras som en brun "tak" på micropyle slutet, äggula bildar ett grått lager på eller nära den andra änden.

Figur 3. Schematisk beskrivning av förfarandet. Vänster: Embryon utan chorion placeras ovanpå en agarplatta och sköt med en nål i hål i agar. Denna montering ger en konsekvent vägledning för alla embryon, med främre hamnar. Höger: Efter centrifugering, embryon är skiktat. Agar är överdragen med TSS (blå) och embryon återhämtat sig från agar med nålen. När upphängd i TSS, kan embryon hämtas upp med en pipett.

Figur 4. Bright ljus bilder av levande Drosophila embryon, som liknar hur de visas i steg 4,1. Embryon visas i standard läggning: framändan till vänster, bakre änden till höger, ryggsidan uppåt och ventrala sidan nedåt. En time-lapse film av tidiga embryogenesen finns som en del av videon som medföljer detta protokoll.

A. Cleavage stadium embryon som är jämnt brun. Stadier gillar det här är idealiska för in-vivo centrifugering.

B. BLASTODERM embryon har en tydlig kant som visas liknande på alla sidor. Denna tydliga periferin är delvis på grund av ansamling av kärnor i plasmamembranet och delvis på grund av aktiv transport av äggula blåsor och droppar lipid ^7. Denna tydliga periferin expanderar tills i slutet av cellularization ^1. Embryon kan fortfarande framgångsrikt stratifieras genom centrifugering fram till slutet av cellularization ^8, men skiktning av äggula och kärnor är inte lika konsekvent som i klyvning steg.

C. Efter cellularization, embryon förekommer asymmetrisk, rygg-och ventral sidor blir tydliga, och olika veck utvecklas. Embryot som visas är i början av grodd-band förlängning. I dessa stadier är centrifugering inte längre effektiva på att stratifiera den stora organeller.

Figur 5. Centrifugeras embryon. Alla embryon i denna siffra var centrifugeras med framändan upp och visas med annan riktning.

A. Ljus-ljus bild av ett framgångsrikt centrifugeras embryo. En brun lager vid mycket framändan beror på lipid-droppe ackumulering. En bred grått lager nära den bakre änden på grund av äggula blåsor. Det finns ofta en klar zon under äggulan skikt, med okänt ursprung. En gulaktig zon är ofta uppenbart ovanför äggulan lagret, det förmodligen representerar mitokondrier. Lösliga proteiner finns i hela tydliga skikt mellan lipid droppar och äggula ^2.

B. embryo i ett ses av epifluorescence mikroskopi under UV-excitation. Den blå autofluorescens kännetecknar äggula hjälper till att identifiera den bakre änden.

C. Embryo centrifugeras under grodd-band förlängning, dvs efter cellularization. Äggula kan fortfarande samlas i bakändan, men annars skiktning är minimal.

D. framgångsrikt stratifierat embryo, efter värme fixering. Den lipid-droppstorlek lagret är vit och fluffig, snarare än mörkbrun som i ofixerade embryon (A).

E. & F. Embryon som uttrycker His2Av-GFP och avbildat av konfokalmikroskopi (modifierad efter ^2). E: centrifugeras vid klyvning steg; His2Av-GFP verkar bara markera lipid-droppstorlek lager eftersom få kärnor bildas vid denna tid. Beroende på fokalplanet kan kärnor syns knappt droppen lagret (visas inte här). F: centrifugeras vid BLASTODERM steg; His2Av-GFP markerar både lipid-droppstorlek lager (överst) och kärnor (i en bred zon under droppen lagret).

Discussion

Kritiska steg

Se till att agar koncentrationen är tillräckligt hög. Om det är för lågt kommer agar sönder under centrifugeringen, och embryona kommer att brista eller vara slumpmässigt orienterade. Om agar koncentrationen ligger lite för lågt eller om agar är våt (otillräckligt torkad eller otillräcklig borttagning av överskott TSS i steg 4,3), kommer embryon flyta ur sina hålor under centrifugering och blir felaktigt inriktad. Om agar hälls för tunt, kommer det att kollapsa också eller spricka under centrifugering.

Se till att embryon inte har avancerat bortom cellularization stadier. Annars kommer separering av organeller fungerar inte (Fig. 5C) sedan organeller blir bundet i tusentals enskilda celler. I yngre embryon i en cell skede organeller är fria att migrera stora avstånd och ansamlas i enlighet med deras karaktäristiska densitet. För att undvika att analysera embryon som är för gamla, se till att (i) inkludera en pre-samling för att honorna att lägga gamla ägg (steg 2,4), (ii) samla in embryon i 3 timmar eller mindre (steg 2,5), (iii) visuellt markera embryon innan cellularization steg för att bädda in agar (steg 4,2), (iv) hålla bädda tiden kort för att förhindra utveckling genom slutet av cellularization (steg 4,6) och (v) kassera embryon som inte lagret på rätt sätt (steg 5,6) .

Inte snåla på centrifugeringstiden. Trots att vissa av embryona kommer att visa fin skiktning även efter bara 10 minuter av centrifugering, är separationen inkonsekvent från embryo till embryo. 30 min snurrar ger mycket konsekventa resultat. Dessutom, ju längre centrifugeringstiden, desto längre lagren är stabila efter centrifugering har upphört. Detta är viktigt för de applikationer där det tar tid att bearbeta embryon ytterligare före användning (t.ex. om de behöver behandlas för transplantation experiment eller monteras för konfokala analys).

Möjliga ändringar

Ägg insamling och chorion borttagning Många olika protokoll för steg 2 och 3 ^{1, 3, 9,} och kommer att fungera lika bra som de som beskrivs här så länge som de använda embryon är unga är ägget ger hög och andelen mis- iscensatt embryon minimeras.

Anterior-posterior justering Protokollet orienterar alla embryon så att den bakre änden är begravd i agar och den främre änden är upp (bild 3). Denna inriktning är bra för konsekvens, så att det är möjligt att använda micropyle som ett landmärke som slut pekade upp under centrifugering (Fig. 1, 5). Men med praktiken är det lätt att plocka ut riktningen för centrifugerade embryon genom de distinkta utseende lipid-droppe och lager äggula med ljus-fält mikroskop. Då blir det möjligt att montera embryon med antingen hamna; denna flexibilitet snabbar upp monteringen processen.

Unoriented centrifugering som mest tidskrävande och tekniskt utmanande aspekt av protokollet är att montera embryon i agar (steg 4). Det kräver att röra varje embryo två gånger (en gång för att sätta in den i hålet och en gång för att återställa det efter centrifugering). Som alternativ kan man överföra embryon vid steg 4,1 till mikrocentrifugrör fyllda med TSS. När dessa rör centrifugeras i mikrocentrifug (13.000 rpm, 10-30 min), embryon kommer också typiskt lager väl ^10-13. Denna variation gör att man kan behandla hundratals embryon på samma gång mycket snabbt. Det är dock skiktning inte så konsekvent, en bråkdel av de embryon inte utveckla distinkta skikt trots mycket högre centrifugalkraft (~ 16 tusen g) än som tillämpas i protokollet ovan. Mer utmanande är att inriktningen på embryon varierar, och man kan observera separation i olika vinklar till de stora embryot axeln. Denna variation måste försöksledaren att sortera efter centrifugering hur ett visst embryo arrangerades i centrifugrör. Med hjälp av äggulan autofluorescens som en markör för den mest täta delen av embryot, är detta ofta möjligt, men det kräver mycket övning och mer dom att göra det säkert. Om det finns tillräckligt med embryon i provet, kan man kunna sortera ut de fall där embryon råkade placeras som i figur. 1.

Centrifugering av embryon i sina äggskal Det är möjligt att bädda in embryon i agar för steg 4 utan att ta bort chorion första ^2. I denna strategi, är embryon om insamling plattan täckt med Halocarbon olja i stället för 50% blekmedel i steg 3.2 (Halocarbon vänder chorion genomskinliga). Embryon av lämpliga steg väljs och överförs till en ny agarplatta med pincett, genom att ta tag bara ägget filament med pincett, skador påembryot rätt undviks. Embryon är inbäddade som i steg 4,4 via 4,8, med den främre ägget trådar sticker upp ur hålet i agar. Den äggskal tas bort med 50% blekmedel behandling efter embryon har centrifugeras och grävde ur agar som i steg 5,4. Centrifugering i närvaro av äggskalet kan förbättra graden av devitellinization efter fixering (steg 6,2), men valet av rätt steg för centrifugering (steg 4,2) är mer utmanande.

Applikationer

Embryo centrifugering är särskilt användbart för colocalization experiment, dvs att testa om ett visst protein lokaliserar till vissa större organell. Till exempel är den Klar protein som finns på tidig embryonal lipiddropparna, är ännu denna lokalisering utmanande att visa i intakta embryon. Delvis beror detta på att både Klar puncta och droppar lipid är riklig i embryot periferin ^10, gör falska colocalization svårt att utesluta. Men koncentrerar centrifugering lipid droppar in i ett separat lager, och därmed blir colocalization med Klar signal uppenbar ^10.

Liknande analys har entydigt visat att lokaliseringen av andra proteiner att lipiddropparna ^{8, 13-15,} inklusive överraskande exempel som vissa histoner ² och i de fall då ett protein finns ubiquitously men berikas på lipiddropparna ^8. Som embryon kan väljas visuellt genom utvecklingsstadiet (steg 4,2), är det ens möjligt att upptäcka utvecklingsstörda reglerade rekrytering av proteiner till lipiddropparna ^{8, 15.} Test för colocalization med lipiddropparna är särskilt enkelt eftersom lipid droppar samlas i en visuellt distinkt "tak", så ingen ytterligare markör eller bets krävs för att identifiera detta skikt. I själva verket, på grund av dess lätthet och potentiellt slående visuella resultat (Fig. 1, Fig. 5. D, E), använder vårt laboratorium denna teknik nu rutinmässigt som en första test om en kandidat protein är lokaliserad till lipid droppar. I princip bör liknande colocalization studier arbete för de andra organeller som visas i figur. 1, och sannolikt för andra (inklusive intracellulära parasiter) som distribueras i centrifugeras embryon har ännu inte dokumenteras.

Sedan centrifugering koncentrerar organeller i trånga band, det underlättar isolering av en bråkdel anrikas i dessa organeller. Detta tillvägagångssätt har redan använts för att återhämta lipiddropparna för transplantation till donatorn embryon ^2. Det kan också vara möjligt att biokemiskt analysera det anrikade fraktionen (t.ex. genom att skära lager av embryon efter fixering ^15).

Metoden som beskrivs här har tillämpningar utanför Drosophila embryon som centrifugeringen kan användas för att stratifiera ägg från många olika arter (bl.a. grodor, nematoder, manteldjur, annelids, sjöborrar, mollusker, och Cnidarians) ^16. I vårt eget laboratorium har vi använt protokollet ovan för embryon av husfluga Musca domestica ² och har anställt unoriented centrifugering i analysen av embryon från svampen gnat Sciara coprophila ¹⁷ och snigeln Ilyanassa obsoleta ^17. Slutligen är denna metod inte begränsat till embryon: Centrifugering kan också vara bra att stratifiera andra stora celler, såsom oocyter (t.ex. i Drosophila ^{2, 18} och milkweed bugg Oncopeltus fasciatus ^17). För olika exemplar, den exakta centrifugering villkor måste optimeras: Till exempel är 10 minuter vid 3000 g är tillräcklig för att effektivt stratifiera embryon Musca domestica ^2, och om centrifugeras mycket längre, embryona tenderar att bryta isär under fixering och immunfärgning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60x15 mm Petri dishes	BD Biosciences	#35-1007	From Falcon
Wire mesh	Small Parts, Inc.	CX-0150	stainless steel type 304; mesh size #150 x150, wire diameter: 0.0026 inches
Tungsten needles	Fine Science Tools	10130-10	0.25 mm
Moria Nickel Plated Pin/Needle Holder	Fine Science Tools	26016-12
Fly Cages	Genesee Scientific	59-100 or 59-101	For 65 mm or 100 mm diameter Petri dishes, respectively
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	H8773