線虫スライド調製:寒天パッド上に動物をマウントする方法

Abstract

出典:Teoh, J. S., et al.線虫の細胞構造とオルガネラ形態を研究するための定量的アプローチ。J. Vis. Exp.(2019年)。

C.エレガンスのライブイメージング中に、アガロースパッドを使用して、線虫を傷つけたり乾燥させたりすることなく静止させることができます。このビデオでは、顕微鏡用の簡単な取り付けパッドを準備する方法を説明しています。

Protocol

このプロトコルは、Teoh et al, Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019) からの抜粋です。

イメージング用スライドの準備

1. 電子レンジ対応ボトル(100mLの超純水に3〜4g)に3〜4%w/vアガロースストックを調製します
   注:寒天は、同じ濃度のアガロースの代わりに使用できます。
2. アガロースを電子レンジで慎重に溶かし、沸騰しすぎないように注意しながら、すべてのアガロースが溶解するまで(透明な溶液)。固化を防ぐために溶液を70°Cに保ちます.
   注:アガロースストックは数回使用できます。アガロースが固まった場合は、使用前に再加熱してください。
3. パスツールピペットを使用して、溶かしたアガロースを顕微鏡スライドに一滴垂らします
   注: 寒天の滴に気泡が入ると、パッドの完全性が損なわれるため、避けてください。
4. すぐに別の顕微鏡スライドでアガロース液滴を押し下げ、アガロースを2つのスライドの間のパッドに優しく平らにします
   注: この段階で、残った気泡を取り除く必要があります。そうでない場合は、動物が泡に引っかかりやすいため、新しいスライドを作成する必要があります。スライドを押すときに寒天が横にオーバーフローしないようにしてください。
5. アガロースを1分間乾燥させます。
6. アガロースの損傷を避けるために、2つのスライドを慎重に分離し、固化したパッドをスライドの1つに残します。
   注: アガロースパッド付きのスライドは、乾燥する可能性があるため、実験の直前に常に新鮮に準備する必要があります。アガロースパッドの厚さが一定であることを確認してください。パッドに気泡や亀裂が入ると、イメージングに支障を
きたす可能性があるため、このことがあってはなりません。
7. 0.05%塩酸テトラミソール(麻酔薬)をアガロースパッドの中央に少量(5〜10μL)加えます。
8. 加熱滅菌したピックを使用して、溶液が乾く前に、ストックプレートから約10〜15匹の動物を麻酔薬液滴にすばやく移します。OP50細菌を移しすぎると溶液が濁り、イメージングに支障をきたす可能性があるため、避けてください。
   注:ピッキング中に麻酔液が乾いた場合は、0.05%塩酸テトラミソールの2滴目を動物にピペットで入れるだけです。動物は麻酔液の側面に横たわる傾向があります。
9. カバースリップをアガロースパッドのすぐ上に配置し、そっと下に落とします。これにより、気泡の形成を防ぎます。カバーガラスに圧力をかけないでください、動物を押しつぶす可能性があります。
10. スライドにひずみ名のラベルを付けます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
寒天	メルク	1.01614.1000
アガロース	インビトゲン	16500-500
ガラスカバースリップ#1	サーモサイエンティフィック	MENCS22221GP
ガラスカバースリップ #1.5	ツァイス	474030-9000-000	SCHOTT製
スライドガラス	サーモサイエンティフィック	MENS41104A/40
パスツールピペット	コーニング	CLS7095D5X-200EA
プラチナワイヤー	シグマ	267201から2G
テトラミソール塩酸塩	シグマ	L9756-5Gの