Detta protokoll är utdraget från Teoh et al, Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
Förberedelse av bilder för avbildning
- Förbered 3-4% w/v agarosebuljong i en mikrovågssäker flaska (3-4 g i 100 ml ultrapurevatten).
OBS: Agar kan användas i stället för agarose vid samma koncentration.
- Smält agarosen försiktigt i en mikrovågsugn, var försiktig så att du inte överkoker, tills all agarose löser sig (klar lösning). Förvara lösningen vid 70 °C för att förhindra stelning.
OBS: Agarose lager kan användas flera gånger. Värm upp före användning om agarosen har stelnat.
- Använd en Pasteur-pipett och placera en droppe smält agarosa på en mikroskoprutschbana.
OBS: Undvik att ha luftbubblor i droppen av agar eftersom dessa stör dynans integritet.
- Tryck omedelbart ner agarosdropparet med ett annat mikroskopreglage och platta försiktigt till agarosen i en kudde mellan de två bilderna.
OBS: Eventuella överblivna bubblor bör tas bort i detta skede. Om inte, bör nya bilder göras eftersom djur lätt kan fastna i bubblorna. Undvik spill av agar åt sidan när du trycker på rutschkanan.
- Låt agarosen torka i 1 minut.
- Separera försiktigt de två bilderna för att undvika skador på agarosen, samtidigt som du lämnar den stelnade dynan på en av bilderna.
OBS: Diabilder med agarose pads bör alltid förberedas färska precis före experimentet eftersom de kan torka ut. Se till att agarosdynan har en jämn tjocklek. Det bör inte finnas några luftbubblor eller sprickor i dynan eftersom detta kan störa avbildningen.
- Tillsätt en liten droppe (5-10 μL) på 0,05% tetramisolehydroklorid (bedövningsmedel) i mitten av agarosdynan.
- Använd värmesteriliserad plockning och överför snabbt cirka 10 – 15 djur från buljongplattan till bedövningsdroppar innan lösningen torkar ut. Undvik att överföra för mycket OP50-bakterier eftersom det gör lösningen grumlig, vilket kan störa avbildningen.
OBS: Om bedövningslösningen torkar ut under plockning, helt enkelt pipett en andra droppe på 0,05% tetramisolehydroklorid på djuren. Djuren tenderar att ligga på sin laterala sida i bedövningslösningen.
- Applicera ett täckskydd genom att placera det precis ovanför agarosdynan och försiktigt släppa ner den. Detta förhindrar bildandet av bubblor. Tryck inte på täcket eftersom det kan krossa djuren.
- Märk bilderna med stamnamnet.
