Nematod Slayt Hazırlama: Agar Pad'e Hayvan Monte Etmek İçin Bir Yöntem

Overview

C. eleganlarıncanlı görüntülenmesi sırasında, nematodu zarar vermeden veya kurutmadan hareketsiz tutmak için bir agarose ped kullanılabilir.  Bu videoda mikroskopi için basit bir montaj pedi nasıl hazırlanacağı açıklanmaktadır.

Protocol

Bu protokol, Caenorhabditis elegans , J. Vis. Exp. (2019)'da Hücresel Yapıları ve Organel Morfolojiyi İncelemek için Nicel Yaklaşımlaradlı Teoh ve ark.'danalıntılanmıştır.

Görüntüleme için slaytların hazırlanması

1. Mikrodalga güvenli bir şişede %3-4 w/v agarose stoğu hazırlayın (100 mL ultra saf suda 3-4 g).
   NOT: Agar, agarose yerine aynı konsantrasyonda kullanılabilir.
2. Agarose'yi mikrodalga fırında dikkatlice eritin, tüm agarose çözünene kadar fazla kaynamamaya dikkat edin (net çözelti). Katılaşmayı önlemek için çözeltiyi 70 °C'de tutun.
   NOT: Agarose stoğu birkaç kez kullanılabilir. Agarose katılaşmışsa kullanmadan önce yeniden ısıtın.
3. Pasteur pipet kullanarak, bir damla erimiş agarose'u mikroskop slaydına yerleştirin.
   NOT: Agar damlasında hava kabarcıklarına sahip olmaktan kaçının, çünkü bunlar ped bütünlüğünü bozar.
4. Agarose damlacığı hemen başka bir mikroskop kaydırağı ile bastırın, agarose'yi iki slayt arasındaki bir ped halinde hafifçe düzleştirin.
   NOT: Kalan kabarcıklar bu aşamada çıkarılmalıdır. Değilse, hayvanlar kabarcıklara kolayca sıkışabileceği için yeni slaytlar yapılmalıdır. Slayda basarken agarın yana taşmasını önleyin.
5. Agarose'yi 1 dakika kurumaya bırakın.
6. Katılaştırılmış pedi slaytlardan birinde bırakırken, agarose'un zarar görmesini önlemek için iki slaydı dikkatlice ayırın.
   NOT: Agarose pedli slaytlar kuruyabilecekleri için deneyden hemen önce her zaman taze hazırlanmalıdır. Agarose pedinin tutarlı bir kalınlıkta olduğundan emin olun. Bu görüntülemeyi engelleyebileceği için pedde hava kabarcıkları veya çatlaklar olmamalıdır.
7. Agarose pedinin ortasına% 0.05 tetramisol hidroklorür (anestezik) küçük bir damla (5-10 μL) ekleyin.
8. Isı sterilize edilmiş çekme kullanarak, çözelti kurumadan önce yaklaşık 10 - 15 hayvanı stok plakasından anestezik damlacığa hızlı bir şekilde aktarın. Çok fazla OP50 bakterisi transfer etmekten kaçının, çünkü bu, çözümü bulanık hale getirir ve bu da görüntülemeyi engelleyebilir.
   NOT: Anestezik çözelti toplanırken kurursa, hayvanlara% 0.05 tetramisol hidroklorür ikinci bir damla pipet. Hayvanlar anestezik çözeltide yanal yanlarına yatma eğilimindedir.
9. Agarose pedinin hemen üzerine yerleştirip yavaşça aşağı bırakarak bir kapak kılıfı uygulayın. Bu kabarcık oluşumunu önleyecektir. Hayvanları ezebileceği için kapak kapağına basınç uygulamayın.
10. Slaytları gerinim adıyla etiketleyin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar	Merck	1.01614.1000
Agarose	Invitrogen	16500-500
Glass coverslips #1	Thermo scientifique	MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5	Zeiss	474030-9000-000	Made by SCHOTT
Glass slides	Thermo scientifique	MENS41104A/40
Pasteur pipette	Corning	CLS7095D5X-200EA
Platinum wire	Sigma	267201-2G
Tetramisole hydrochloride	Sigma	L9756-5G