Summary
मध्यस्थ चयापचयों का विश्लेषण जीसी / एमएस के लिए नमूना तैयार करने की विधि urease इसके आविष्कारक द्वारा प्रस्तुत है. विधि की अनुमति देता है एक कदम बढ़ाता कार्बोहाइड्रेट, एक प्रक्रिया में सभी कार्बनिक और एमिनो एसिड द्वारा नवजात स्क्रीनिंग की सहज त्रुटियों के लिए अनुवर्ती अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा.
Abstract
हर अमेरिका में पैदा हुए शिशु अब 42 दुर्लभ आनुवंशिक विकारों के लिए है के लिए जांच की चयापचय की सहज त्रुटियों "बुलाया. स्क्रीनिंग विधि अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित है और कार्बनिक acidemias के लिए एक स्क्रीन के रूप में acylcarnitines quantifies और भी अमीनो एसिड के उपाय. सभी राज्यों को भी galactosemia जैसे कार्बोहाइड्रेट विकारों के लिए enzymatic परीक्षण प्रदर्शन करते हैं. क्योंकि परिणाम गैर विशिष्ट, सकारात्मक परिणाम के अनुवर्ती परीक्षण किया जा सकता है एक और अधिक निश्चित पद्धति का उपयोग करके आवश्यक है. वर्तमान रिपोर्ट "urease" जन्मजात त्रुटि जांच के लिए नमूना तैयार करने की विधि का वर्णन है. क्रिस्टलीय urease एंजाइम शरीर के तरल पदार्थ है जो अधिकांश अन्य पानी में घुलनशील चयापचयों निर्जलित और derivatized गैस क्रोमैटोग्राफी के लिए एक ही प्रक्रिया में करने के लिए परमिट से यूरिया को दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक नाइट्रोजन धारा में वाष्पीकरण से निर्जलीकरण acetonitrile और methylene क्लोराइड जोड़कर मदद की है. फिर, trimethylsilylation एक अद्वितीय उत्प्रेरक, triethylammonium trifluoroacetate की उपस्थिति में जगह लेता है. स्वचालित इंजेक्शन और क्रोमैटोग्राफी मैक्रो संचालित 192 चयापचयों और हर प्रमुख घटक टीएमएस derivatized जैविक यौगिकों के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा के विशेष पुस्तकालयों का उपयोग कर की मात्रा का ठहराव अर्द्ध कस्टम मात्रा का ठहराव के द्वारा पीछा किया जाता है. विश्लेषण व्यापक रूप से इस्तेमाल किया Chemstation मैक्रोज़ और लेखक की ओर से उपलब्ध पुस्तकालयों का उपयोग कर मंच पर प्रदर्शन किया जा सकता है. कि, नमूने के परिणाम के 17% है निष्कर्ष है कि आदेश चिकित्सक द्वारा पर काम किया जाना चाहिए पता चलता है - हमारी प्रयोगशाला में, 16,000 से अधिक मरीज के नमूनों के बारे में 17% की एक नैदानिक उपज के साथ विधि का उपयोग किया गया विश्लेषण किया है. इन में शामिल 180 पुष्टि की सहज त्रुटियों, जिनमें से 38% के बारे में नहीं किया गया है पिछले विधियों का उपयोग कर निदान सकता है खत्म हो गई हैं.
Protocol
मूत्र नमूने के प्रसंस्करण के लिए प्रक्रिया
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मूत्र का नमूना पहले गला लें. एक नई कंटेनर में छानना अगर मूल समझौता किया है.
- नमूना के 13 मिलीलीटर की एक अधिकतम विभाज्य ले लो और एक लेबल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में -20 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान.
- Refractometer में मूत्र की बूंदों के एक जोड़े रखने के द्वारा नमूना के ऑप्टिकल घनत्व उपाय और रिकॉर्ड.
- 0.2 उम फिल्टर के माध्यम से नमूना फ़िल्टर.
- ऑप्टिकल घनत्व के अनुसार नीचे नमूने की मात्रा उपाय
1.000-1.009 1.00 मिलीलीटर 1.010-1.019 0.50 मिलीलीटर 1.020-1.050 0.25 मिलीलीटर + 0.25 मिलीलीटर एच 2 हे - निर्दिष्ट मात्रा तो एक Reactivial निम्नलिखित आंतरिक मानकों से युक्त स्थानांतरित किया है: 500 (nmoles) nanomoles Creatine 3, 10 nmoles घ 3 Methylmalonic एसिड, 100 nmoles निम्नलिखित 3 सी लैक्टेट 13 के प्रत्येक 13 सी 3 पाइरूवेट, 15 13 2 सी एन ग्लाइसिन, घ सेरीन 3, घ 5 फेनिलएलनिन, घ 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotate, घ 4 sebacic एसिड, 13 सी 6 ग्लूकोज, घ 6 inositol और घ 5 tryptophan.
- एक 7.5 इकाइयों / urease के μl समाधान (Calzyme प्रयोगशालाओं सूची नहीं 116A0100.) के 20 microliters (μl) नमूना है, जो और फिर प्लावित है एक आभ्यांतरिक पट के माध्यम से सीओ 2 के तहत बंद करने के लिए जोड़ा जाता है.
- नमूना 37 डिग्री सेल्सियस के लिए आयोजित किया जाता है और अधिक कार्बन डाइऑक्साइड गैस के साथ 30 मिनट 15 मिनट के अंतराल पर दबाव बनाए रखने.
- 20 μl urease समाधान के अधिक जोडी है, शीशी कार्बन डाइऑक्साइड के साथ प्लावित है, और नमूना एक और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा.
- 30:70 एसीटोन के 500 μl: मेथनॉल जोडी है, रबर पट एक Teflon लेपित पट के साथ प्रतिस्थापित किया गया है, और नमूना -20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ठंडा है.
- ठोस 1500 rpm x 10 फिर एक साफ 2.0 सीसी Reactivial (/ Supelco सिग्मा) में decanted मिनट पर centrifugation द्वारा हटा रहे हैं
- निम्नानुसार triethylammonium trifluoroacetate (चाय / TFA) (सिग्मा) जोड़ें:
- 1.00 मिलीलीटर नमूने के लिए 20 μl
- 0.5 मिलीग्राम या कम नमूने, के लिए 40 μl
- 70 पर एक नाइट्रोजन धारा के तहत acetonitrile और जगह के साथ बंद शीर्ष डिग्री सेल्सियस तक निरंतर मात्रा हासिल की है (/ चाय TFA रहेगा) (~ 15 मिनट).
- 13 कदम दोहराएँ, जब तक एक वेग रूपों (~ 10 मिनट प्रत्येक) अप करने के लिए 4 बार.
- के बारे में 2 मिनट के लिए शांत करते हैं. Methylene क्लोराइड के साथ बंद शीर्ष फोड़ा सावधान अधिक, और सूखी जा रहा है (~ 4:00 मिनट).
- 15 कदम दोहराएँ.
- निम्नलिखित दरों पर MSTFA (एन मिथाइल - एन trimethylsilyltrifluoroacetamide -) (थर्मल वैज्ञानिक) जोड़ें:
- 1.00 मिलीलीटर नमूने के लिए 150 μl
- 0.50 मिलीग्राम या कम नमूने, के लिए 200 μl
- माहौल नाइट्रोजन एक और सेते के तहत 70 पर कैप ° सी 1 घंटे के लिए.
- Microvials स्थानांतरण, गैस स्पेक्ट्रोमीटर / chromatograph जन पर विश्लेषण के लिए एक नाइट्रोजन के वातावरण के अंतर्गत.
- Agilent 5975 जीसी / एमएस द्वारा स्वचालित इंजेक्शन के लिए प्लेस microvials: साधन तापमान हैं: सुई लगानेवाला 200 ° सी, 250 अंतरफलक डिग्री सेल्सियस, ओवन 80 ° सी, 1 मिनट के लिए 4 में रैंप ° सी / 80-130 मिनट पर रैंप ° सी, 6 ° सी / 130-200 मिनट डिग्री सेल्सियस, 12 में रैंप ° सी / 200-285 मिनट डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए पकड़. स्तम्भ: 25 मीटर, 320 माइक्रोन आईडी, 0.5 माइक्रोन फिल्म मोटाई डीबी 5. मास युक्ति: स्रोत 230 डिग्री सेल्सियस, ट्रैक्टर 150 ° सी, 2.46 स्कैन / सेकंड में स्कैन 50-650 एएमयू. सॉल्वेंट देरी 3.5 मिनट है.
प्रतिनिधि परिणाम
कृपया यहाँ क्लिक करें प्रतिनिधि परिणाम देखने के.
Discussion
urease विधि (1) विभिन्न संशोधनों के साथ चिकित्सा साहित्य में 62 बार उद्धृत किया गया है. मात्सुमोतो समूह (2,3) उच्च throughput नवजात स्क्रीनिंग के लिए प्रक्रिया सरल और 16000 रोगियों से परिणाम की सूचना दी. Kuhara और दूसरों (4-7) सहज त्रुटि निदान के कई मामलों में विधि के प्रयोग की सूचना दी है और अप का पालन करें. Rhead (8) भी नैदानिक निदान के लिए विधि की उपयोगिता की पुष्टि की और सहज त्रुटियों के अप का पालन करें. विधि भालू के मूत्र के लिए लागू किया गया है, चूहों, हाथी, और homogenates पूरे फल मक्खियों और उनके लार्वा (9) के बाहर दस्तक. क्रिप्टोकोकस से पहले और बाद में साइट - निर्देशित mutagenesis संस्कृति मीडिया भी urease कदम (10) के बिना विश्लेषण किया गया . विधि मेडिकल छात्रों में किया गया है मानव पोषण मूल्यांकन करने के लिए लागू, अमीनो tryptophan, methionine और isoleucine एसिड (11) की मौखिक खुराक के साथ विषयों के लदान के बाद डाउन सिंड्रोम के रोगियों और बावला बुजुर्ग दिग्गजों. सभी आठ बी विटामिन तीन अमीनो एसिड है, जो उन के बीच में, उनके गिरावट में कुछ बिंदु पर सभी 8 विटामिन की आवश्यकता के टूटने उत्पादों को बढ़ाता द्वारा मूल्यांकन किया गया. विटामिन अनुपूरण द्वारा दवाइयों और उनके शमन के विषाक्त प्रभाव बताया गया है (12). सामान्य और डाउन सिंड्रोम गर्भधारण से amniotic द्रव के नमूने विश्लेषण किया गया और रिपोर्ट (13-15).
Disclosures
मेटाबोलिक स्क्रीनिंग लैब एक CLIA लाइसेंस नैदानिक सेंट लुई विश्वविद्यालय, एक गैर लाभ निगम द्वारा स्वामित्व में प्रयोगशाला है. डा. मोची सीधे प्रयोगशाला राजस्व से लाभ, नहीं है, लेकिन प्रयोगशाला उत्पादकता से परोक्ष रूप से लाभ हो सकता है. विधियों, तकनीक, परिणाम, सामान्य पर्वतमाला, मैक्रोज़, सॉफ्टवेयर, पुस्तकालयों, या निष्कर्ष में से कोई भी मालिकाना माना जाता है और स्वतंत्र रूप से इच्छुक पार्टियों के लिए उपलब्ध हैं.
Acknowledgments
एंथोनी थॉमस सक्षम तकनीकी सहायता आभार स्वीकार किया है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MSD 5975 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| MSD 5973 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes | ||
| Solvents | Fisher Scientific | ||
| Analytes | Sigma-Aldrich | ||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | |
| TEA/TFA | Fluka | 09747 | |
| Vials | Supelco, Sigma-Aldrich | Z115088/12EA | |
| Merlin Microseal | Agilent Technologies | 5181-8815 | |
| MSTFA | Thermal Scientific, Inc. | 48913 |
References
- Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease. J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).
- Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).
- Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening. Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).
- Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).
- Kuhara, T. Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).
- Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).
- Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).
- Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).
- Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).
- Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans. Eukaryotic Cell. , (2010).
- Shoemaker, J. D. Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading. , (1992).
- Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report. Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes. Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies. Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid. Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).
