Fireveis olfactometeranalyse: En metode for å vurdere luktfrie svar i Drosophila

Abstract

Kilde: Lin, C.C., et al. Olfactory Behaviors Analysert av Computer Tracking Of Drosophila i et fire-kvadrant Olfactometer. J. Vis. Utt. (2016).

Fruktfluer har et komplekst olfaktorisk system, kan diskriminere hundrevis av luktstoffer og bruke luktesansen til å lede atferdsbeslutninger. Denne videoen beskriver den fireveis olfactometeranalysen, en metode for å studere olfaktoriske atferdsresponser hos fluer. Det utvalgte protokollklippet viser hvordan du håndterer testfluer og hva som er kritiske trinn mens du utfører analysen.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Lin et al., Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016).

1. Atferdsrespons på attraktive og avstøtende luktstoffer

1. Slå på temperaturregulatoren og sett den på 25 °C.
2. Koble luktkamrene (kontroll og test luktstoffer) ved å sette slangen inn i utløpet av luktkammeret og til push-to-connect-beslaget på atferdsboksen.
3. Kontroller strømningshastigheten i hver kvadrant ved å bruke luftstrømsmåleren for å sikre at kontroll- og luktluftstrømmene er lik 100 ml/min.
4. Rengjør PTFE flyarenaen og glassplatene med 70% etanol 2-3 ganger og la dem lufttørke fullt ut (~ 3-4 min).
5. Fest glassplatene til arenaen med klemmer.
6. Overfør fluer uten CO₂ anestesi inn i arenaen gjennom hullet i en av glassplatene. Etter overføringen legger du et sirkulært nett på hullet for å forhindre at fluer unnslipper.
   MERK: CO₂ anestesi har vist seg å påvirke Drosophila oppførsel og bør ikke brukes innen 24 timer etter et atferdseksperiment.
7. Plasser arenaen med fluer inn i det lyse tette kammeret, koble de fire kontrollluftstrømmene ved å koble slangen festet til push-to-connect-beslaget på atferdsboksen til arenahjørnene, lukk døren til kammeret og vent 10-15 min for å la fluene akklimatisere seg til det nye miljøet. Hvis det er mulig, slå av lysene i rommet der forsøkene utføres, for å unngå mulig minimal lyslekkasje som kan påvirke det eksperimentelle utfallet.
8. Kjør et 5-10 min kontrolleksperiment, der fluer blir utsatt for 4 kontrollluftstrømmer.
9. Analyser dataene umiddelbart (se Dataanalyse-delen nedenfor) for å sikre at fluene fordeles jevnt i arenaen, og attraksjonsindeksen er nær 0. Dette trinnet er viktig, da det bekrefter at det ikke er noen ukontrollerte kilder til preferanse eller unngåelse i arenaen (f.eks. lyslekkasje fra utsiden, ujevn temperaturfordeling, ujevn arena, luktforurensning, etc.). Hvis fluene fordeles ulikt eller deres lokomotoriske aktivitet er lav, kast fluene, rengjør arenaen igjen (trinn 1.4) og bruk en ny gruppe fluer for å gjenta eksperimentet.
10. Koble testluktantkammeret til oppsettet ved å slå på 3-veisventilene eller koble kontaktrørene på nytt.
11. Kjør testeksperiment i 5-10 min og analyser dataene som beskrevet i avsnitt 2 nedenfor (Figur 1). Opptak som er lengre enn 20 minutter, kan føre til datafiler som kan være vanskelige å behandle. Hvis det ønskes lengre eksperimentelle opptak, stopper du raskt og starter sporingsprogrammet på nytt. Dette resulterer i et gap på ~ 10 sek mellom eksperimentelle opptak.
12. Kast fluer.
13. Rengjør arena- og glassplatene med 70 % etanol (trinn 1.4) og skift ut koblingsrørene i det lyse tette kabinettet. For å fremskynde eksperimenter kan en ny ren arena brukes, og den skitne arenaen rengjøres mens du utfører eksperimentelle løp.
14. Kjør et nytt eksperiment med en ny gruppe fluer, om nødvendig. Hvis flere eksperimenter kjøres på samme dag, må du være svært forsiktig med å sikre at det ikke blir igjen lukt i systemet fra en tidligere testkjøring. Dette er normalt ikke et problem med lave konsentrasjoner av luktstoffer eller med CO₂, men for svært konsentrerte stimuli opptil 24 timers gap mellom eksperimentelle løp kan det være nødvendig. I tillegg kan alle slanger etter strømningsrørene byttes ut hvis luktforurensning mistenkes under kontrollforsøk. La alltid den tørre luften stå på mellom forsøkene for å skylle systemet kontinuerlig.

2. Dataanalyse

MERK: Den foreslåtte programvaren for flysporingsanskaffelse (beskrevet i Materialer), sporer fluer i sanntid under oppkjøpet, og sparer tidsstempel og koordinater for alle oppdagede fluer i * .dat format. Vi har utviklet en skreddersydd Matlab-rutine for å konvertere dataene til et Matlab-format, og for å analysere dataene. Kodeeksempler er gitt i tilleggsmaterialer, men detaljer om implementering vil avhenge av programvaren som brukes til datainnsamling.

1. Last inn rådataene. Opprett en romlig maske som følger konturene av arenaen, og bruk masken på rådataene for å fjerne alle datapunkter som faller utenfor arenaen når de representerer støy (Figur 2A, EkstrakodemaskeSpatialFiltering.m, Resultat.m, DrawCircMaskular.m).
2. Fjern alle datapunkter som beveger seg med en hastighet under 0,163 cm/s lenger enn 3, da disse dataene sannsynligvis vil være støy eller generert av fluer som ikke beveger seg (Figur 2B, Tilleggskode TemporalFiltrering.m).
3. Visualiser gjenværende datapunkter ved å plotte dem ut på en gang eller som enkeltbaner (Figur 1, Tilleggskode SingleTrajectoryViewer.m).
   MERK: Plasseringen av luktgrenser i firefeltet avhenger sannsynligvis av en rekke faktorer, for eksempel egenskapene til hvert luktstoff og luftstrømmen som brukes. For eksempel vil svært flyktige luktstoffer sannsynligvis fylle luktkvadranten mer fullstendig enn mindre flyktige luktstoffer. Dermed er det sannsynlig at hver luktkant kan vise litt forskjellige luktgrenser. Bruken av en fotoioniseringsdetektor for å måle luktgrenser kan være problematisk da den bruker et vakuum for å prøve luft fra et bestemt sted, og forstyrrer luktkonsentrasjonen på det stedet. Likevel kan luktgrenser raskt estimeres basert på flyadferdsdata. For eksempel kan en luktgrense basert på kumulerte flyspor som svar på forskjellige lukt, tydelig observeres i figur 1C og 1D.
4. Beregn en tiltrekningsindeks for å avgjøre om kontrolleksperimenter ikke genererer noen preferanserespons, og også for å få tilgang til responsen på en lukt (eller optogenetisk) stimulans. Hvis du vil beregne en tiltrekningsindeks (AI), bruker du de siste 5 min av en kontroll eller testregistrering. For å oppnå et mål på tiltrekning som faller mellom +1 (absolutt tiltrekning) og -1 (absolutt frastøtelse), brukes følgende formel til å beregne AI:
   
   der _N-test er antall datapunkter i testkvadranten, er _N-kontroll gjennomsnittlig antall datapunkter i de tre kontrollkvadrantene. Dette tiltaket er intuitivt, da ingen preferanser vil bli indikert med nesten null verdier. Det indikerer imidlertid ikke riktig andelen av det totale antall fluer som ligger i den luktende kvadranten. For å oppnå dette målet kan en prosentindeks (PI) brukes:
   
   der _N-test er antall datapunkter i testkvadranten, og N_totalt er det totale antallet datapunkter i alle fire kvadrantene. Denne formelen gir et mål som faller mellom 0 og 1, med 0,25 som tilsvarer ingen atferdsmessig preferanse (Figur 1E og 2C, Tilleggskode AttractionIndex.m).
5. Kjør 5-10 repetisjoner av hver eksperimentelle tilstand, ved hjelp av en ny gruppe fluer for hver repetisjon. Sammenlign tiltrekningsindeksene mellom betingelser eller kontroller ved hjelp av kolmogorov-Smirnov ikke-parametrisk test (Figur 1F, kstest2-funksjonen i Matlab).

Results

Figur 1: Eksempeldata generert ved hjelp av en olfaktorisk analyse med fire felt. (A) Skjematisk for firefeltsarenaen. (B) Nøytrale reaksjoner observeres når alle fire kvadrantene bare inneholder tørrluftperfusjon. (C) Tiltrekning svar på en 6,25% fortynning av eple cider eddik perfused fra venstre øvre kvadrant. (D) Avstøtningsvirkemåter utløst av 10 % e...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<strong>Air delivery system</strong>			<strong>(Quantity needed)</strong>
<em><strong>Tubing and connectors</strong></em>
Thermoplastic NPT(F) Manifolds	Cole-Parmer, IL, USA	R-31522-31	1
Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, USA	5232T314	1
Tubing (ID:1/8)	McMaster-Carr, IL, USA	5108K43	50 Ft
Tubing (ID:1/16)	McMaster-Carr, IL, USA	52355K41	100 Ft
Barbed tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5117K71	1 pack
Push-to-connect tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5779K102	4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K439	1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K438	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K4	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5670K84	1
Hex head plug	McMaster-Carr, IL, USA	48335K152	1
<em><strong>Air pressure regulator, air filter and flowmeters</strong></em>			<strong>(Quantity needed)</strong>
Labatory gas drying unit	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA	Model: L68-NP-303; stock #26840	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-30	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-76	1
150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R-03217-15	9
Valve Cartridge	Cole-Parmer, IL, USA	R-03218-72	9
Precision Air regulator	McMaster-Carr, IL, USA	6162K13	1
Soleniod valves	Automate Scientific, Berkeley, CA	02-10i	4
Solenoid valve controller	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA	18-Jan	1
Electronic flow meter	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a	National Instruments	NI USB-6009	1
Power supply	Extech Instruments	382200	1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml	Nalgene	562118-0002	At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz	Sunburst Bottle	LB4B	At least 5 are required per experiment
"In" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	214224PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	224214PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring	RT Dygert International, MN, USA	AS568-029 Buna-N O-R	1 pack (100)
<em><strong>Fly arena, camera and behavior boxes</strong></em>			<strong>(Quantity needed)</strong>
Behavior and camera box material	Interstate plastics, CA, USA	ABS black extruded (<a href="https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php" target="_blank">https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php</a>)	1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12"	McMaster-Carr, IL, USA	8545K27	1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9"	McMaster-Carr, IL, USA	8476K191	2
Dual action thermoelectric controller	WAtronix Inc, CA, USA	DA12V-K-0	1
IR LED array	Advanced Illumination, Rochester, VT, USA	AL4554-88024, PS24-TL	2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit	Melcor Store	MAA280T-12	1
<em><strong>Imaging system</strong></em>			<strong>(Quantity needed)</strong>
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	PEC21211 KP	1
CCXC-12P05N Interconnect Cable	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SOCCXC12P05N	1
DC-700 Camera Adapter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SODC700	1
B+W 40,5 093 IR filter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	65-072442	1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer	Amazon		1
IR Videocamera	Industrial Vision Source, FL, USA	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB video converter	The Imagingsource, NC, USA	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (fly tracking software)	Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
IC Capture software	The Imagingsource, NC, USA	(<a href="https://www.theimagingsource.com/" target="_blank">http://www.theimagingsource.com/</a>)
<strong>Miscellaneous</strong>			<strong>(Quantity needed)</strong>
Dremel rotary tool	Dremel, Racine, WI, USA	Dremel 8000-03	1
Diamond-coated drill bits for glass cutting	Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY	90606328	1