Overview
Fruktflugor har ett komplext luktsystem, kan diskriminera hundratals luktämnen och använda sitt luktsinne för att rikta beteendebeslut. Denna video beskriver fyrvägs olfactometer analys, en metod för att studera lukt beteendemässiga svar i flugor. Det presenterade protokollklippet visar hur man hanterar testflugor och vad som är kritiska steg när du utför analysen.
Protocol
Detta protokoll är ett utdrag från Lin et al., Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016).
1. Beteendemässiga svar på attraktiva och repellent luktämnen
- Slå på temperaturregulatorn och ställ in den på 25 °C.
- Anslut luktkamrarna (kontroll- och testlukterare) genom att föra in slangen på luktkammarens utlopp och till push-to-connect-armaturen på beteendeboxen.
- Kontrollera flödeshastigheten i varje kvadrant genom att använda luftflödesmätaren för att se till att manöver- och luktluftströmmarna är lika med 100 ml/min.
- Rengör PTFE fly arena och glasplattorna med 70% etanol 2-3 gånger och låt dem helt lufttorka (~ 3-4 min).
- Fäst glasplattorna på arenan med klämmor.
- Överför flugor utanCO 2 anestesi till arenan genom hålet i en av glasplattorna. Efter överföringen, placera ett cirkulärt nät på hålet för att förhindra flugor från att fly.
OBS: CO2 anestesi har visat sig påverka Drosophila beteende och bör inte användas inom 24 timmar efter ett beteendeexperiment. - Placera arenan med flugor i den ljustäta kammaren, anslut de fyra styrluftströmmarna genom att ansluta slangarna som är fästa vid push-to-connect-monteringen på beteendeboxen till arenahörnen, stäng kammarens dörr och vänta 10-15 min för att låta flugorna acklimatisera sig till den nya miljön. Stäng om möjligt av lamporna i rummet där experimenten utförs, för att undvika eventuell minimal ljusläckage som kan fördomsfulla det experimentella resultatet.
- Kör ett 5-10 minuters kontrollexperiment, där flugor utsätts för 4 kontrollluftströmmar.
- Analysera data omedelbart (se avsnittet Dataanalys nedan) för att se till att flugorna fördelas jämnt i arenan och Attraktionsindex är nära 0. Detta steg är viktigt, eftersom det verifierar att det inte finns några okontrollerade källor till preferens eller undvikande inom arenan (t.ex. ljus som läcker från utsidan, ojämn temperaturfördelning, ojämn arena, luktförorening etc.). Om flugorna fördelas ojämnt eller deras lokomotoriska aktivitet är låg, kassera flugorna, rengör arenan igen (steg 1.4) och använd en ny sats flugor för att upprepa experimentet.
- Anslut provdodorantkammaren till installationen genom att slå på 3-vägsventilerna eller ansluta anslutningsrören igen.
- Kör testexperiment i 5-10 min och analysera data enligt avsnitt 2 nedan (Figur 1). Inspelningar som är längre än 20 minuter kan resultera i datafiler som kan vara svåra att beräknings bearbeta. Om längre experimentella inspelningar önskas, stoppa och starta snabbt om spårningsprogrammet. Detta resulterar i ett ~10 sek mellanrum mellan experimentella inspelningar.
- Kassera flugor.
- Rengör arena- och glasplattorna med 70 % etanol (steg 1.4) och byt ut anslutningsrören i det ljustäta höljet. För att påskynda experiment kan en ny ren arena användas, och den smutsiga arenan städas medan experimentella körningar.
- Kör ett annat experiment med en ny sats flugor, om det behövs. Om flera experiment körs samma dag, var extremt försiktig så att ingen lukt finns kvar i systemet från en tidigare testkörning. Detta är normalt inte ett problem med låga koncentrationer av luktämnen eller med CO2, men för högkoncentrerade stimuli upp till ett 24 timmars mellanrum mellan experimentella körningar kan behövas. Dessutom kan alla slangar efter flödesrören bytas ut om lukta kontaminering misstänks under kontrollförsök. Lämna alltid den torra luften på mellan experimenten för att kontinuerligt spola systemet.
2. Dataanalys
OBS: Den föreslagna flugspårningsförvärvsprogramvaran (detaljerad i Material), spår flyger i realtid under förvärvet och sparar tidsstämpeln och koordinaterna för alla upptäckta flugor i *.dat format. Vi har utvecklat en skräddarsydd Matlab-rutin för att konvertera data till ett Matlab-format och för att analysera data. Kodexempel finns i kompletterande material, men detaljer om implementering beror på vilken programvara som används för datainsamling.
- Läs in rådata. Skapa en rumslig mask som följer arenans konturer och applicera masken på rådata för att ta bort alla datapunkter som faller utanför arenan när de representerar brus (Bild 2A, Kompletterande kod MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
- Ta bort alla datapunkter som rör sig med en hastighet under 0,163 cm/s längre än 3s, eftersom dessa data sannolikt kommer att vara brus eller genereras av icke-rörliga flugor(figur 2B, Kompletterande kod TemporalFiltering.m).
- Visualisera återstående datapunkter genom att rita ut dem alla på en gång eller som enstaka banor (Figur 1, Kompletterande kod SingleTrajectoryViewer.m).
OBS: Placeringen av luktgränser inom fyrafältet beror sannolikt på ett antal faktorer, såsom egenskaperna hos varje lukt och de luftflöden som används. Till exempel kommer mycket flyktiga luktämnen sannolikt att fylla luktkvadranten mer fullständigt än mindre flyktiga luktämnen. Således är det troligt att varje luktare kan uppvisa något olika luktgränser. Användningen av en fotojoniseringsdetektor för att mäta luktgränser kan vara problematisk eftersom den använder ett vakuum för att ta prov på luft från en viss plats, och stör därför luktkoncentrationen på den platsen. Icke desto mindre kan luktgränser snabbt uppskattas baserat på flugbeteendedata. Till exempel kan en luktgräns baserad på kumulerade flugspår som svar på olika lukter tydligt observeras i figur 1C och 1D. - Beräkna ett attraktionsindex för att avgöra om kontrollexperiment inte genererar något preferenssvar, och även för att komma åt svaret på en lukt (eller optogenetisk) stimulans. Om du vill beräkna ett attraktionsindex (AI) använder du de sista 5 minuterna av en kontroll- eller testinspelning. För att få ett mått på attraktion som faller mellan +1 (absolut attraktion) och -1 (absolut repulsion) används följande formel för att beräkna AI:
Om N-provningen är antalet datapunkter i provningskvadranten är N-kontrollen det genomsnittliga antalet datapunkter i de tre kontrollkvadranterna. Detta mått är intuitivt eftersom ingen preferens skulle indikeras med nära noll värden. Det indikerar dock inte korrekt andelen av det totala antalet flugor som ligger i luktkvadranten. För att erhålla detta mått kan ett procentindex (PI) användas:
där N-provningen är antalet datapunkter i testkvadranten, ochN-totalsumman är det totala antalet datapunkter i alla fyra kvadranterna. Den här formeln innehåller ett mått som faller mellan 0 och 1, med 0,25 som inte motsvarar någon beteendemässig preferens (figur 1E och 2C, Kompletterande kod AttractionIndex.m). - Kör 5-10 repetitioner av varje experimentellt tillstånd, med hjälp av en ny grupp flugor för varje upprepning. Jämför attraktionsindexen mellan förhållanden eller mot kontroller med hjälp av kolmogorov-Smirnov icke-parametriskt test(figur 1F,kstest2-funktionen i Matlab).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bild 1: Exempeldata som genereras med hjälp av en olfaktorisk analys med fyra fält. A)Schemat för fyrfältsarenan. B)Neutrala svar observeras när alla fyra kvadranterna endast innehåller torr luftperfusion. (C)Attraktionssvar på en utspädning på 6,25% av äppelcidervinäger perfused från den vänstra övre kvadranten. (D) Repulsion beteenden utlöses av 10% etylpropionat. I figur 2B-2D ritas en enda bana från de förvärvade uppgifterna. En färggradient används för att ange inspelningstiden, med blå och röda färger som början respektive slutet av inspelningar. (E) Jämförelse av attraktionsindex (AI) och procentindex (PI). (F) Genomsnittlig AI med 3- 6 experiment utan lukt (kontroll), äppelcidervinäger (ACV) och 10% etylpropionat (EP). Felstaplar indikerar SEM. Statistisk skillnad utvärderades av Kolmogorov-Smirnov-testet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2: Exempeldata som genereras av dataanalysstegen. (A) Rumslig filtrering av data, utförd av MaskSpatialFiltering.m för att ta bort datapunkter som faller utanför arenan. Röda cirklar visar initiala positioner för de cirklar som används för att definiera arenans gränser. Svarta cirklar är de slutliga positionerna, som förvärvas genom att montera cirkelkonturerna på data (grå skuggat område inuti fyrafältet). Röda punkter och svarta pilspetsar anger datapunkter som ska tas bort från datauppsättningen efter det här filtreringssteget. (B) Temporal filtrering av data, utförd av TemporalFiltering.m. Detta filtreringssteg tar bort datapunkter som rör sig mycket långsamt eller inte alls, eftersom de sannolikt kommer att genereras av icke-rörliga flugor eller av smuts / reflektioner från arenan. En röd prick omgiven av en streckad röd ruta anger positioner på ~6 000 datapunkter med identiska koordinater som ska tas bort av det här filtreringssteget. (C) Attraction Index (AI) och Percentage Index (PI), beräknat i 10-sekunders papperskorgar under de senaste 5 minuterna av ett experiment av AttractionIndex.m. Temporala profiler av dessa index innehåller information om dynamiken i beteendemässiga svar och kan användas för detaljerad analys av beteenden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande kodfil. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50 Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100 Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1 pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 18-Jan | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture software | The Imagingsource, NC, USA | (http://www.theimagingsource.com/) | |
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
