从成年苍蝇中分离米古特：分离消化道的方法

Overview

在这段视频中，我们重点介绍了成人 德罗索菲拉 肠的解剖和适合单细胞分离和FACS的中腹集合，以便分离肠道干细胞。

Protocol

该协议是陶克 等人的摘录，由FACS从成人嗜睡干细胞中分离肠道干细胞，以研究衰老期间的干细胞行为，J.Vis.Exp。(2014).

注：如果此协议首次用于通过 FAC 排序来隔离 ISC，则必须采用以下控件，以便最初正确设置 FACS 参数：将细胞与野生类型（如w^1118）分离，无需 Sytox。 从野生类型（如w^1118）与西毒杆菌分离的细胞（见步骤3.6）。分离细胞从esg-Gal4的中谷，UAS-GFP飞行线没有西毒。

1. 为古特解剖准备解决方案和菜肴

1. 准备4-6瓶每个包含40只雌性苍蝇从esg-Gal4，UAS-GFP飞行线。
2. 从 10 倍 PBS 库存解决方案准备 500 毫升 1x PBS （1.8 mM NaH₂PO₄•H₂O， 8.4 mM Na₂HPO₄•2H₂O， 175 mM 纳克， 调整 pH 到 7.4）.
3. 在 1x PBS 中准备 3.5% 的 agarose 溶液（100 毫升 1x PBS 中出现 3.5 g 电泳等级）。将此溶液倒入培养皿（直径 8.5 厘米）以覆盖底部，从而准备解剖板。在解剖过程中，agarose 层可防止损坏钳子的尖端。凝胶凝固后，将解剖板存放在4°C。
4. 在解剖前准备 300 毫升 1x PBS + 1% BSA 新鲜，并将瓶子放在冰上或 4 °C。
5. 打开离心机，让它冷却到4°C。
6. 点燃2个玻璃巴斯德移液器的尖端，以平滑边缘。
7. 用70%乙醇清洁两对钳子和一把剃须刀刀片。
8. 放置四到六个1.5毫升的微中微管，用于收集冰上解剖的中谷。

2. 准备胃肠道和中古特解剖

1. 麻醉苍蝇从一小瓶（40只苍蝇）与CO₂ 在标准飞床上，斩首所有苍蝇使用剃刀刀片，并转移他们到解剖盘。将冷 1 倍 PBS/1% BSA 溶液倒入解剖盘中，以覆盖糖凝胶。苍蝇会漂浮。
2. 用一对钳子抓住苍蝇腹部，同时用另一对钳子抓住胸腔。将胸腔与腹部分开。肠道将是可见的，前肢/作物将最有可能仍然连接到胸腔。
3. 抓住肠道，把它从胸腔里拉出来。要展开肠道，抓住庄稼，将肠道稍微从腹部拉开。
4. 用一对钳子抓住腹部的后端，用另一对钳子抓住前开的皮质层的边缘。小心不要破坏突出的肠道组织。拉开后端，打破皮质层，继续非常轻轻地拉后，直到整个肠道被拉出腹腔。如果作物太大，无法穿过体腔，则可能需要事先将其移除。
5. 取出前肢、马尔皮吉安管、后痛和卵巢，留下裸露的中块。
6. 使用玻璃巴斯德移液器，将一批解剖过的中牙转移到含有冷 1x PBS/1% BSA 溶液的 1.5 毫升微中轴管中，并将管子保持在冰上。样品必须在 2 小时内处理。
7. 整批的解剖完成后，用双蒸馏水冲洗解剖盘，洗掉残留的碎片。开始解剖下一批中谷（重复步骤 2.1–2.7）。在 2 小时内尽可能多地解剖批次，然后进行步骤 3.1。

3. 将古特组织消化到收获细胞进行 FAC 分拣

1. 从中腹中取出 1x PBS/1% BSA 溶液，并在每个样品中加入 500 μl 的 0.5% Trypsin-EDTA 解决方案。
2. Vortex 好 20 秒，在室温下以 20 rpm 温和摇动/旋转 25-30 分钟来孵化样品。
3. 约30分钟后再次漩涡，让完整的中螺组织沉入管子底部。小心地取出用火焰玻璃巴斯德移液器悬浮的细胞，并通过 35μm 尼龙网过滤成新鲜的 1.5 毫升微中流管。
4. 在 4 °C 下以 100 x g 的速度将细胞向下旋转 5 分钟。 值得注意的是，当开始消化时，细胞颗粒一开始可能不可见，但随着组织消化的进展，会变得可见。
   1. 小心地将 Trypsin 溶液传回含有剩余完整中腹组织的原始样品管。避免从颗粒中转移过多的细胞。
   2. 轻轻地将细胞颗粒重新悬浮在 400 μl 的冷 1x PBS/1% BSA 中。将含有分离细胞的微中燃料管保留在冰上，用铝箔覆盖管子，以保护细胞免受光线的照射。
   3. 再次将含有剩余完整中腹组织的Trypsin溶液漩涡，并在室温下将样品放在摇车上30分钟。
5. 重复步骤 3.3 到 3.4.3，直到所有中古特组织被消化。将所有微中流管分离的细胞组合成一个微中心管。这可能需要像 3.4 中那样进行离心步骤，因为所有细胞悬架的总体积可能超过 1.5 毫升。将细胞悬浮在冰上，保护细胞免受光线的照射。
6. 在 100 x g 下旋转分离的细胞，在 4 °C 下旋转 5 分钟。 小心地去除尽可能多的超自然体，在微中轴管中留下大约 50-100 μl 的 1 倍 PBS/1% BSA 溶液。在含有 Sytox （1：20，000） 的 800 μl 1x PBS/1% BSA 中轻轻补充分离的细胞。
7. 通过细胞过滤器捕捉盖（35μm尼龙网）过滤细胞，将细胞悬架转移到 5 毫升圆底猎鹰管。始终将细胞样本保存在冰上，防止光线照射。细胞现在已准备好进行排序。
8. 将 600 μl 的 RNAlater 溶液放入每个微中线管中，将细胞分类到该管中，用于随后的 RNA 隔离。对于其他下游应用，细胞可以收集到不同的溶液中，例如无菌 PBS 中。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting