ניתוח המדרש מטיסת מבוגר: שיטה לבודד את מערכת העיכול

Overview

בסרטון זה, אנו מדגישים ניתוח של המעי Drosophila הבוגר ואוסף של midguts מתאים דיסוציאציה של תא יחיד FACS על מנת לבודד תאי גזע במעיים.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך טאק ואח ',בידוד תאי גזע מעיים מן מידגוטים Drosophila למבוגרים על ידי FACS ללמוד התנהגות תאי גזע במהלך ההזדקנות, J. Vis. Exp. (2014).

שים לב: אם פרוטוקול זה משמש לראשונה לבידוד ISCs על-ידי מיון FAC, הפקדים הבאים הם חובה כדי להגדיר בתחילה את הפרמטרים של FACS כראוי: תאים מנותקים מסוג פראי (למשל w¹¹¹⁸) Drosophila midguts ללא Sytox. תאים מנותקים מסוג פראי (למשל w¹¹¹⁸) drosophila midguts עם Sytox (ראה שלב 3.6). תאים מנותקים מן midguts של esg-Gal4, UAS-GFP לטוס קו ללא Sytox.

1. הכנת פתרונות ומנות לניתוח מעיים

1. הכינו 4-6 בקבוקונים שכל אחד מהם מכיל 40 זבובים נשיים מקו הזבובים esg-Gal4,UAS-GFP.
2. מתמיסת מניית PBS 10x הכן 500 מ"ל 1x PBS (1.8 מ"מ NaH₂PO₄· H₂O, 8.4 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 175 mM NaCl, להתאים את ה-pH ל 7.4).
3. הכן פתרון 3.5% agarose ב 1x PBS (3.5 g אלקטרופורזה כיתה agarose ב 100 מיליליטר 1x PBS). מכינים צלחות ניתוח על ידי שפיכת פתרון זה לתוך צלחות פטרי (קוטר 8.5 ס"מ) כדי לכסות את החלק התחתון. שכבת agarose מונע פגיעה בקצות המלקחיים במהלך הליך הניתוח. לאחר שהג'ל התגבש יש לאחסן את לוחות הניתוח ב 4 מעלות צלזיוס.
4. הכן 300 מ"ל של 1x PBS + 1% BSA טרי לפני ניתוח ומניחים את הבקבוק על קרח או ב 4 מעלות צלזיוס.
5. הפעל צנטריפוגה ולתת לו להתקרר ל 4 מעלות צלזיוס.
6. להבה את קצות 2 פיפטות פסטר זכוכית כדי להחליק את הקצוות.
7. נקה שני זוגות מלקחיים וסכין גילוח אחד עם 70% אתנול.
8. מניחים ארבעה עד שישה צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל לאיסוף מידגטס מנותח על קרח.

2. הכנת מערכת העיכול וניתוק של מידגוט

1. הרדמה זבובים מבקבוקון אחד (40 זבובים) עם CO₂ על מיטת זבוב סטנדרטית, לערוף את כל הזבובים באמצעות סכין גילוח ולהעביר אותם לצלחת הניתוח. יוצקים תמיסת BSA קרה 1x/1% לתוך צלחת הניתוח כדי לכסות את ג'ל agarose. הזבובים יצופו.
2. תפוס את הבטן לעוף עם זוג אחד של מלקחיים, תוך החזקת בית החזה עם זוג מלקחיים אחרים. הפרד את בית החזה מהבטן. המעיים יהיו גלויים ואת foregut / יבול סביר להניח עדיין יהיה מחובר לבית החזה.
3. תפוס את המעיים ומשוך אותו מתוך בית החזה. כדי לפתוח את המעיים, לתפוס את היבול ולמשוך את המעיים מעט מראש מן הבטן.
4. תפוס את הקצה האחורי של הבטן עם זוג אחד של מלקחיים ואת הקצה של קוטיקולה פתוחה באופן ראשון עם זוג מלקחיים אחרים. היזהר לא להרוס את רקמת המעיים הבולטת. משוך את הקצה האחורי משם כדי לשבור את הקוטיקולה ולהמשיך למשוך את החלק האחורי בעדינות רבה עד שהמעיים כולו נשלף מחלל הבטן. היבול עשוי להיות מוסר מראש אם הוא גדול מדי כדי להתאים דרך חלל הגוף.
5. הסר את הצבי, צינוריות Malpighian, hindgut ושחלות עוזב את midgut חשוף.
6. באמצעות פיפטה פסטר, להעביר את הקבוצה של midguts מנותח צינור microcentrifuge 1.5 מל המכיל קר 1x PBS / 1% פתרון BSA ולשמור את הצינור על הקרח. הדגימות חייבות להיות מעובדות תוך שעתיים.
7. לאחר הניתוח של אצווה שלמה הושלמה, לשטוף את צלחת הניתוח עם מים מזוקקים כפול לשטוף את השאר על פסולת. התחל לנתח את האצווה הבאה של סוגי ביניים (חזור על שלבים 2.1-2.7). לנתח אצוות רבות ככל האפשר בתוך 2 שעות, ולאחר מכן להמשיך לשלב 3.1.

3. עיכול רקמת המעיים לתאי הקציר למיון FAC

1. הסר את הפתרון 1x PBS/1% BSA מן midguts ולהוסיף 500 μl של 0.5% פתרון טריפסין-EDTA לכל מדגם.
2. וורטקס היטב במשך 20 שניות ולהדגיר את הדגימות על ידי נדנדה עדינה / סיבוב ב 20 סל"ד בטמפרטורת החדר במשך 25 - 30 דקות.
3. וורטקס שוב לאחר כ 30 דקות ולתת רקמת midgut שלם לשקוע לתחתית הצינור. בזהירות להסיר את התאים כי הם בהשעיה עם פיפטה פסטר זכוכית להבה ולסנן אותם דרך רשת ניילון 35 מיקרומטר לתוך צינור טרי 1.5 מיליליטר microcentrifuge.
4. לסובב את התאים למטה ב 100 x g במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שימו לב, בעת תחילת העיכול, גלולה תא לא יכול להיות גלוי בהתחלה אבל יהיה גלוי כמו תקציר הרקמה מתקדמת.
   1. בזהירות להעביר את פתרון טריפסין בחזרה לצינור המדגם המקורי המכיל את רקמת midgut שלם הנותרים. הימנע העברת תאים רבים מדי מן גלולה.
   2. בעדינות להשעות את גלולת התא ב 400 μl של קר 1x PBS/ 1% BSA. שמור את צינורות microcentrifuge המכילים את התאים מנותקים על הקרח לכסות את הצינורות עם רדיד אלומיניום כדי להגן על התאים מפני אור.
   3. וורטקס פתרון טריפסין המכיל את רקמת midgut שלם הנותרים שוב ומניחים את הדגימות על הנדנדה עוד 30 דקות בטמפרטורת החדר.
5. חזור על שלבים 3.3 עד 3.4.3 עד שכל רקמת הביניים מתעכלת. שלב את התאים המנותקים מכל צינורות המיקרוצנטריפוגה לצינור מיקרוצנטריפוגה אחד. זה עשוי לדרוש שלב צנטריפוגה כמו ב 3.4, שכן נפח של כל השעיות התא בשילוב עשוי לחרוג 1.5 מיליליטר. שמור את המתלה התא על קרח ולהגן על התאים מפני אור.
6. סובב את התאים המנותקים כלפי מטה ב- 100 x g למשך 5 דקות ב- 4 °C (60 °F). הסר בזהירות כמה שיותר של supernatant ככל האפשר משאיר כ 50-100 μl של 1x PBS / 1% פתרון BSA בצינור microcentrifuge. בעדינות resuspend התאים מנותקים ב 800 μl 1x PBS / 1% BSA המכיל Sytox (1:20,000).
7. להעביר את השעיית התא צינור פלקון עגול 5 מ"ל על ידי סינון התאים באמצעות כובע הצמד מסננת תאים (רשת ניילון μm 35 מיקרומטר). תמיד לשמור דגימות תאים על קרח ומוגן מפני אור. התאים מוכנים כעת למיון.
8. פיפטה 600 μl של פתרון RNAlater לתוך כל צינור microcentrifuge לתוכו התאים ימוינו לבידוד RNA הבאים. עבור יישומים אחרים במורד הזרם ניתן לאסוף את התאים בפתרון אחר, למשל ב- PBS סטרילי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting