成虫ハエからのミドグの解剖:消化管を分離する方法

Overview

このビデオでは、単細胞解離およびFACSに適した成人 ショウジョウバエ 腸管の解剖と、腸幹細胞を単離するためにFACSの採取を強調する。

Protocol

このプロトコルは、タウス らからの抜粋であり、老化中の幹細胞の挙動を研究するためにFACSによって成体ショウジョウバエミダッツから腸幹細胞を分離する、J.Vis. Exp.(2014).

注:このプロトコルを使用して FAC のソートによって ISC を初めて分離する場合、FACS パラメータを最初に適切に設定するためには、次のコントロールが必須です。 野生型(例えばw¹¹¹⁸⁾ショウジョウバエ中腸のシトックスを用いた解離細胞(ステップ3.6を参照)。esg-Gal4の中間の腸から解離された細胞は、シトックスを含まないUAS-GFPフライラインである。

1. 腸管解剖のためのソリューションと料理の準備

1. エスグ-Gal4、UAS-GFPフライラインから40匹のメスハエを含む4〜6バイアルをそれぞれ準備します。
2. 10x PBSストック溶液から 500 ml 1x PBS (1.8 mM NaH₂PO₄·H₂O, 8.4 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 175 mM NaCl, pHを 7.4 に調整します。
3. 1x PBS(100 ml 1x PBSで3.5g電気泳動グレードアガロース)に3.5%のアガロース溶液を調製します。底部を覆うために、この溶液をシャーレ(直径8.5cm)に注ぎ込み、解剖プレートを準備します。アガロース層は、解剖手順中に鉗子の先端を損傷するのを防ぎます。ゲルが固化した後、解剖板を4°Cで保存する。
4. 解剖する前に新鮮な1x PBS + 1%BSAの300 mlを準備し、ボトルを氷の上または4°Cに置きます。
5. 遠心分離機を入れ、4°Cに冷却します。
6. 2ガラスパスツールピペットの先端を炎上してエッジを滑らかにします。
7. 70%エタノールで2組の鉗子と1つのカミソリブレードを洗浄します。
8. 解剖したミッドガッツを氷の上に集めるために4〜6個の1.5mlマイクロ遠心分離管を置きます。

2. 消化管の調製と中腸の解剖

1. 標準的なフライベッド上のCO₂ を持つ1つのバイアル(40ハエ)からハエを麻酔し、カミソリの刃を使用してすべてのハエを切断し、解剖皿に移します。冷たい1x PBS/1%BSA溶液を解剖皿に注ぎ、アガロースゲルを覆います。ハエが浮かぶでしょう。
2. 他の鉗子で胸郭を保持しながら、鉗子の1ペアでフライ腹部をつかみます。胸郭を腹部から分離します。腸は目に見え、前腸/作物はまだ胸郭に接続されている可能性が最も高いです。
3. 腸をつかんで胸郭から引き出します。腸を展開するには、作物をつかみ、腹部から少し前から腸を引っ張ります。
4. 一対の鉗子と、他の鉗子のペアで前から開いたキューティクルの端で腹部の後端をつかむ。突出した腸組織を破壊しないように注意してください。後端を引き離してキューティクルを壊し、腸全体が腹腔から引き出されるまで後部を非常に穏やかに引っ張り続けます。作物は、体腔を通して収まるには大きすぎる場合は、事前に除去する必要があります。
5. 前腸、マルピギアン細管、後腸および卵巣を取り除き、裸の中腸を残します。
6. ガラスパスツールピペットを使用して、解剖したミドガットのバッチを、冷たい1x PBS/ 1%BSA溶液を含む1.5mlマイクロ遠心分離チューブに移し、チューブを氷の上に置きます。サンプルは2時間以内に処理する必要があります。
7. バッチ全体の解剖が完了した後、二重蒸留水で解剖皿を洗い流し、残りの破片を洗い流します。次のバッチの中腸の解剖を開始します(ステップ2.1~2.7を繰り返します)。2時間以内にできるだけ多くのバッチを解剖し、ステップ3.1に進みます。

3. FAC選別のための細胞を収穫する腸組織の消化

1. 1x PBS/1% BSA溶液を中間から取り出し、各サンプルに0.5%トリプシン-EDTA溶液の500 μlを加えます。
2. 20秒間ボルテックスウェル、25〜30分間室温で20rpmで穏やかな揺れ/回転してサンプルをインキュベートします。
3. 約30分後に再び渦を起たし、無傷の中腸組織をチューブの底に沈める。炎のガラスパスツールピペットで懸濁液中の細胞を慎重に取り除き、35 μmのナイロンメッシュを通して新鮮な1.5 mlマイクロ遠心チューブにフィルターします。
4. 4°Cで5分間、細胞を100 x gで下します。 注意すべきは、消化を開始すると、細胞ペレットは最初は見えないかもしれないが、組織消化が進むにつれて見えるようになる。
   1. 慎重にトリプシン溶液を残りの無傷のミドガット組織を含む元のサンプルチューブに戻します。ペレットからあまりにも多くの細胞を転送しないでください。
   2. 細胞ペレットを400 μlの冷たい1x PBS/1%BSAに静かに再中断します。氷の上に解離した細胞を含むマイクロ遠心チューブを維持し、光から細胞を保護するためにアルミニウム箔でチューブをカバーします。
   3. 再び残りの無傷のミドグ組織を含むトリプシン溶液をボルテックスし、室温でさらに30分間ロッカーにサンプルを置きます。
5. すべての中腸組織が消化されるまで、ステップ3.3〜3.4.3を繰り返します。すべてのマイクロ遠心チューブから解離した細胞を1つのマイクロ遠心分離チューブに結合します。これは、組み合わせたすべての細胞懸濁液の体積が1.5mlを超える場合があるため、3.4のように遠心分離工程を必要とすることがある。細胞懸濁液を氷の上に保ち、細胞を光から守ります。
6. 解約した細胞を100 x gで4°Cで5分間回転させます。 マイクロ遠心チューブに約50-100 μlの1x PBS/1%BSA溶液を残して、できるだけ多くの上清を慎重に除去します。シトックスを含む800 μl 1x PBS/1% BSA (1:20,000) で解約細胞を静かに再懸濁します。
7. セルストレーナースナップキャップ(35 μmナイロンメッシュ)を通して細胞をろ過して、セルサスペンションを5mlのラウンドボトムファルコンチューブに移します。常に氷の上に細胞サンプルを保持し、光から保護します。これで、セルを並べ替える準備ができました。
8. ピペット600 μlのRNAlater溶液を各マイクロ遠心分離チューブに入れ、その後のRNA分離のために細胞を選別します。他の下流の適用のために細胞は、例えば滅菌PBSで、別の溶液で収集することができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting