سي إليغانز تتبع الحركة: طريقة لتقييم الحركة في الديدان

Overview

يصف هذا الفيديو استخدام برامج الفيديو والتتبع لتسجيل حركة الدودة في الساحة.  يقيس البروتوكول المثال تأثير التعرض للإيثانول على حركة الدودة.

Protocol

البروتوكول التالي هو مقتطف من ديفيز وآخرون ، وهو مقصي لقياس آثار الإيثانول على سرعة الحركة من elegans Caenorhabditis، J. Vis. Exp. (2015).

1. خطوات لتنفيذ في اليوم السابق لل المقايسة

   1. اختيار الديدان المرحلة L4 إلى الديدان الخيطية الطازجة المتوسطة النمو (NGM) لوحات المبذر مع حديقة من OP50 E. القولونية, والثقافة لهم في 20 درجة مئوية O / N. كل شرط الفحص يتطلب 10 الديدان; اختيار فائض من الديدان للسماح لفقدان O / N من الديدان.
      1. فقط الحيوانات المقايسة التي هي الكبار في اليوم الأول; العديد من المسوخ تنمو بسرعة أبطأ من نوع البرية. ضبط توقيت قطف للسلالات التي لديها تأخر في النمو بحيث تكون جميع الحيوانات التي تم اختبارها من البالغين في اليوم الأول.
2. خطوات لتنفيذ في يوم من المقايسة
   1. التحضير للمقاايسة:
      1. إجراء المقايسات على لوحات معيار غير المصنف 60 × 15 ملم NGM. قم بتجفيف جميع الأطباق لاستخدامها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين، مع إيقاف الأغطية. لكل تجربة تجريبية، استخدم أربع لوحات NGM مجففة. وستكون هذه 0 MM و 400 mM لوحات الايثانول المقايسة ولوحات التكيف المصاحبة لها.
         ملاحظة: استخدام لوحات NGM مهم هنا. الاختلافات في تكوين لوحات، ولا سيما osmolarity بهم، يمكن أن تؤثر بقوة على استجابة جرعة الإيثانول على السلوك، وهذا يرجع، على الأقل جزئيا، إلى التغيرات في كمية الإيثانول التي تراكمت من قبل الحيوانات. NGM أجار هو 160 mOsm.
      2. بعد التجفيف، وزن كل من لوحات NGM غير المصنف لاستخدامها في المقايسة وملاحظة الوزن. تحديد حجم الوسائط في لوحات على أساس وزن لوحة فارغة. لتقريب تحويل وزن أجار إلى حجم، افترض أن وسائل الإعلام يزن نفس حجم متساو من الماء.
         ملاحظة: وقد تم العثور على نتائجنا الأكثر اتساقا مع وسائل الإعلام NGM التي المجففة بما فيه الكفاية أن حجم 10 مل الأصلي لديه حجم ما بعد التجفيف بين 8.3-8.9 مل. بديل لوقت الجفاف 2 ساعة هو أن تجف حتى لوحات تصل إلى هذا النطاق حجم لحساب الاختلافات في الحاضنات.
      3. تذوب 4 حلقات النحاس (القطر الداخلي من 1.6 سم) في سطح كل من لوحات لتكون بمثابة زريبات لمختلف الأنماط الجينية أو مجموعات العلاج من الديدان. فهم كل حلقة مع ملقط، والحرارة في لهب (لهب قوي من الموقد بونسن يعمل بشكل جيد) لمدة 3 ثوان تقريبا. ضع الخاتم على الفور على طبق بينما لا يزال يحمل الخاتم مع ملقط لمنعه من "تخطي".
         1. تأكد من أن الطوق تقع شقة ضد سطح أجار عن طريق الضغط إلى أسفل بلطف مع ملقط في عدة نقاط على الحلبة. عند وضع الخاتم، يجب الحرص على ترك مساحة لثلاث حلقات إضافية.
         2. تذوب الحلقات النحاسية الثلاث الإضافية في سطح اللوحة ، مع الحرص على وضعها في أقرب وقت ممكن بحيث تكون جميع الحلقات الأربعة في مجال رؤية الكاميرا.
            ملاحظة: صنع ختم جيد مع أجار أمر ضروري للحفاظ على الديدان في الحلقات أثناء الفحص. الخواتم التي تخطي حولها على لوحة من غير المرجح أن تجعل الختم الصحيح مع أجار، وربما ندبة أجار، والذي يسمح للديدان لحفر ويتداخل مع تصور الديدان.
         3. لكل لوحة المقايسة إعداد لوحة "التأقلم" المصاحبة، والتي ينبغي أن تكون المجففة وغير المصنفة، وسوف تتلقى أي الإيثانول. ضع أربع حلقات نحاسية على هذه اللوحات.
      4. تسمية الجزء السفلي من لوحات بجانب كل حلقة مع سلالة دودة لاستخدامها في الحلبة، مع الحرص على عدم الكتابة في مجال عرض الحلبة نفسها. تطابق التسميات على لوحة المقايسة مع لوحة التأقلم المصاحبة لها.
      5. حساب كمية الإيثانول 100٪ لإضافتها إلى كل لوحة المقايسة بحيث يكون التركيز النهائي 0 mM أو 400 mM الإيثانول (الوزن إلى الحجم). لكل تجربة (n = 1) ، سيكون هناك صفيحة إيثانول واحدة 0 mM و 400 mM ؛ لوحات التأقلم لا تتلقى الإيثانول. إضافة الإيثانول، pipetting حول سطح لوحة. استخدام فيلم المختبر لختم لوحة والسماح لها لتوازن على أعلى مقاعد البدلاء لمدة 2 ساعة.
      6. عند انقضاء 1.5 ساعة، ابدأ خطوة التأقلم في المقايسة، الخطوة 2.2.
   2. إجراء فحص الحركة: لوحات المقايسة
      1. نقل بعناية 10 الديدان من كل مجموعة تجريبية إلى مركز حلقة النحاس على لوحة التأقلم. إزالة أي طعام مرئي على أجار عند هذه النقطة عن طريق كشط بلطف مع اختيار دودة. تختلف الترتيب الذي يتم وضع المجموعات التجريبية على لوحات عبر التجارب التجريبية بحيث لا يتم وضع نفس السلالات على لوحات في نفس الترتيب عبر التجارب.
         ملاحظة: والهدف من ذلك هو نقل الحيوانات إلى لوحة مع كميات ضئيلة من المواد الغذائية، لأنه إذا تم نقل الطعام على لوحة التأقلم إلى لوحة المقايسة الديدان سوف تتجمع حول الغذاء وتأثير الدواء على الحركة سيتم حجب.
      2. يجب الحرص على عدم كسر سطح أجار مع اختيار، وهذا سوف يسمح للديدان لحفر وسوف تعطل المقايسة. احتضان الديدان في RT لمدة 30 دقيقة.
      3. تأكد من وجود فاصل زمني مناسب بين بدء كل لوحة. يمكن للمجرب من ذوي الخبرة نقل 40 حيوانا ، 10 / حلقة لمدة 4 حلقات في و 1.5 دقيقة ، ولكن أي فاصل زمني يصل إلى 2 دقيقة مقبول. يحتوي الفحص القياسي على تسجيل أفلام في 10-12 دقيقة و 30-32 دقيقة من التعرض لكل من 0 mM و 400 mM الإيثانول.
      4. بدء لوحة التأقلم للتعرض 0 mM ولوحة التكيف للتعرض 400 mM ما يقرب من 2 دقيقة و 30 ثانية وبصرف النظر للسماح لحفظ ملف الفيلم الأول قبل الفيلم الثاني يجب أن تبدأ.
      5. بعد فترة التكيف 30 دقيقة، نقل الديدان من لوحات التأقلم إلى لوحات المقايسة. نقل الديدان إلى لوحات المقايسة (0 mM أو 400 mM الإيثانول) بنفس الترتيب الذي أضيفت إلى لوحة التأقلم، وتتبع التوقيت بين الانتهاء من كل لوحة. ختم لوحة مع فيلم المختبر لتقليل فقدان الإيثانول إلى التبخير.
      6. استخدام حركة مغرفة مع اختيار دودة مسطحة رقيقة الحواف لجمع الديدان على رأس اختيار بالارض. إجراء نقل الديدان من لوحة التأقلم غير المصنف إلى لوحة المقايسة دون استخدام البكتيريا ، والتي تستخدم عادة في نقل الديدان لأنها تساعد على لصق الدودة على الانتقاء.
         ملاحظة: السرعة التي يتم بها نقل الحيوانات في هذه الخطوة مهمة للغاية لأن الديدان الأولى على اللوحة ستتعرض للإيثانول لفترة أطول من الديدان الأخيرة المضافة إلى اللوحة ، وقد تظهر النقاط الزمنية السابقة بعض الآثار المعتمدة على الوقت. هذا هو السبب الرئيسي للدوران الذي يتم وضع السلالات على لوحة الأولى عبر يكرر التجريبية.
   3. أداء Locomotion المقايسة : تصوير
      1. استخدم تركيبة مجهر/كاميرا تسمح بالتصوير المتزامن لجميع الحلقات الأربع في مجال الرؤية (حوالي 42^×42 مم مربع مربع)، مثل هدف المجهر 0.5x، والتكبير 0.8x وكاميرا مع 2048x2048 7.4 ميكرومتر بكسل CCD.
      2. استخدام الإضاءة حتى عبر مجال الرؤية، والذي يساعد في التعرف على الكائن في خطوة عتبة كثافة. A 3 "x3" الإضاءة الخلفية يعمل بشكل جيد.
      3. صورة الديدان على لوحة وضع الجانب وسائل الإعلام حتى (غطاء لأسفل)، مما يولد التباين الذي يتم فقدان عند استخدام الإضاءة الخلفية مقارنة مع مصدر الضوء المجهر التقليدية المرسلة.
      4. إعداد برنامج تحليل الصور لالتقاط أفلام الفاصل الزمني للديدان المتحركة. قم بتعيين البرنامج لالتقاط صور ذات مقياس رمادي 12 بت كل ثانية واحدة، كفيلم لمدة دقيقتين (120 إطارا). لتقليل حجم ملف الإخراج، مع الاحتفاظ بدقة صورة كافية، استخدم وضع binning 2x2 لالتقاط صور بكسل 1024×1024.
      5. سجل الأفلام. ابدأ بتسجيل فيلم من 120 إطارا من اللوحة الأولى (0 mM الإيثانول) بعد 10 دقائق من وضع الديدان الأخيرة على تلك اللوحة. حفظ ملف الفيلم.
      6. سجل اللوحة الثانية (400 مليون إيثانول). كرر هذه العملية لكلا الطبقين بداية من 30 دقيقة بعد وضع الديدان الأخيرة على اللوحة الأولى (0 mM الإيثانول) لالتقاط النقاط الزمنية 30-32 دقيقة لكل التعرض.
         ملاحظة: السماح بوقت كاف لحفظ ملفات الصور بعد كل جلسة التقاط قبل بدء تسجيل اللوحة التالية ليتم تحليلها.
      7. من أجل التدقيق المستقبلي للأفلام المؤرشفة والسماح بفتح هذه الأفلام وتحليلها من قبل برامج التصوير مفتوحة المصدر الأخرى في المجال العام ، مثل ImageJ ، قم بتحويل نسخة من كل فيلم إلى ملفات TIFF ذات مقياس رمادي 8 بت 256.
         ملاحظة: يستخدم برنامج تحليل الصور الموضح هنا تنسيق ملف خاص.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.