C. elegans Tracciamento del movimento: un metodo per valutare la locomozione nei vermi

Overview

Questo video descrive l'uso di software video e di tracciamento per registrare il movimento del worm in un'arena.  Il protocollo di esempio misura l'effetto dell'esposizione all'etanolo sulla locomozione dei vermi.

Protocol

Il seguente protocollo è un estratto da Davies et al, An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).

1. Passaggi da eseguire il giorno prima del saggio

   1. Raccogliere i vermi stadio L4 su piatti freschi di mezzo di crescita del nematode (NGM) seminati con un prato di OP50 E. colie coli e coltarli a 20 °C O/N. Ogni condizione di dosaggio richiede 10 vermi; raccogliere un eccesso di vermi per consentire la perdita di O/N di vermi.
      1. Solo animali di dosaggio che sono adulti del primo giorno; molti mutanti crescono ad una velocità più lenta rispetto al tipo selvaggio. Regolare i tempi di prelievo per i ceppi che hanno ritardi nello sviluppo in modo che tutti gli animali testati siano adulti del primo giorno.
2. Passi da eseguire il giorno del saggio
   1. Preparazione per il saggio:
      1. Eseguire saggi su piastre NGM standard non sementi da 60 x 15 mm. Asciugare tutte le piastre da utilizzare a 37 °C per 2 ore, con coperchi spenti. Per ogni prova sperimentale, utilizzare quattro piastre NGM essiccate; queste saranno le piastre di dosaggio dell'etanolo da 0 mM e 400 mM e le relative piastre di acclimatazione.
         NOTA: L'uso di piastre NGM è importante in questo caso; le differenze nella composizione delle piastre, in particolare la loro osmolarità, possono influenzare fortemente la risposta alla dose di etanolo sul comportamento, ciò è dovuto, almeno in parte, ai cambiamenti nella quantità di etanolo accumulata dagli animali. L'agar NGM è di 160 mOsm.
      2. Dopo l'essiccazione, pesare ciascuna delle piastre NGM non sementi da utilizzare nel saggio e annotare il peso. Determinare il volume dei supporti nelle piastre in base al peso di una piastra vuota. Per approssimare la conversione del peso dell'agar in volume, si supponga che il supporto pesi lo stesso di un volume uguale di acqua.
         NOTA: I nostri risultati più coerenti sono stati trovati con supporti NGM che si sono disidratati a sufficienza che un volume originale di 10 ml ha un volume post-essiccazione compreso tra 8,3 e 8,9 ml. Un'alternativa al tempo di asciugatura di 2 ore è asciugare fino a quando le piastre raggiungono questo intervallo di volume per tenere conto delle differenze negli incubatori.
      3. Sciogliere 4 anelli di rame (diametro interno di 1,6 cm) nella superficie di ciascuna delle piastre per fungere da recinti per i diversi genotipi o gruppi di trattamento dei vermi. Afferrare ogni anello con le forcep e riscaldare in una fiamma (una fiamma forte di un bruciatore Bunsen funziona bene) per circa 3 secondi. Posizionare immediatamente l'anello su una piastra mentre si tiene ancora l'anello con le forcep per evitare che "saltasse".
         1. Assicurarsi che l'anello poggia piatto contro la superficie dell'agar premendo delicatamente verso il basso con le forcep in diversi punti dell'anello. Quando si posiziona l'anello, fare attenzione a lasciare spazio per altri tre anelli.
         2. Sciogliere i tre anelli di rame aggiuntivi nella superficie della piastra, facendo attenzione a posizionarli il più vicino possibile in modo che tutti e quattro siano nel campo visivo della fotocamera.
            NOTA: Fare un buon sigillo con l'agar è essenziale per tenere i vermi negli anelli durante il saggio. È improbabile che gli anelli che saltano sul piatto emettano il sigillo corretto con l'agar e possano spaventare l'agar, che consente ai vermi di scavare e interferisce con la visualizzazione dei vermi.
         3. Per ogni piastra di dosaggio preparare una piastra di "acclimatazione" di accompagnamento, che deve essere asciugata e non seminata e non riceverà etanolo. Posizionare quattro anelli di rame su queste piastre.
      4. Etichettare la parte inferiore delle piastre accanto a ciascun anello con il ceppo di verme da utilizzare nell'anello, facendo attenzione a non scrivere nel campo visivo dell'anello stesso. Abbinare le etichette sulla piastra di dosaggio con la relativa piastra di acclimatazione.
      5. Calcolare la quantità di etanolo al 100% da aggiungere a ogni piastra di dosaggio in modo che la concentrazione finale sia di 0 mM o 400 mM di etanolo (peso in volume). Per ogni esperimento (n = 1), ci saranno una piastra di etanolo da 0 mM e una piastra di etanolo da 400 mM; le piastre di acclimatazione non ricevono etanolo. Aggiungere l'etanolo, tubazione intorno alla superficie della piastra. Utilizzare pellicole da laboratorio per sigillare la piastra e consentirgli di equilibrare sul piano del banco per 2 ore.
      6. Quando sono trascorse 1,5 ore, iniziare la fase di acclimatazione del saggio, passo 2.2.
   2. Eseguire test di locomozione: piastre di dosaggio
      1. Trasferire con cura 10 vermi di ogni gruppo sperimentale al centro di un anello di rame sulla piastra di acclimatazione. Rimuovere qualsiasi cibo visibile sull'agar a questo punto raschiando delicatamente con il piccone del verme. Variare l'ordine in cui i gruppi sperimentali vengono messi sulle piastre attraverso prove sperimentali in modo che gli stessi ceppi non siano messi sulle piastre nello stesso ordine tra le prove.
         NOTA: L'obiettivo è quello di trasferire gli animali nel piatto con quantità minime di cibo, perché se il cibo sulla piastra di acclimatazione viene trasferito sul piatto di dosaggio i vermi si aggregeranno intorno al cibo e l'effetto del farmaco sulla locomozione sarà oscurato.
      2. Fai attenzione a non rompere la superficie dell'agar con il piccone, in quanto ciò consentirà ai vermi di scavare e interromperà il saggio. Incubare i vermi a RT per 30 minuti.
      3. Assicurarsi che vi sia un intervallo appropriato tra le iniziazioni di ogni piastra. Uno sperimentatore esperto può spostare 40 animali, 10/anello per 4 anelli in < 1,5 min, ma qualsiasi intervallo fino a 2 minuti è accettabile. Il saggio standard ha film che registrano a 10-12 minuti e 30-32 minuti di esposizione sia per 0 mM che per 400 mM di etanolo.
      4. Avviare la piastra di acclimatazione per l'esposizione di 0 mM e la piastra di acclimatazione per l'esposizione di 400 mM a circa 2 minuti e 30 secondi di distanza per consentire il salvataggio del primo file filmato prima dell'inizio del secondo filmato.
      5. Dopo il periodo di acclimatazione di 30 minuti, trasferire i vermi dalle piastre di acclimatazione alle piastre di dosaggio. Trasferire i vermi sulle piastre di dosaggio (0 mM o 400 mM di etanolo) nello stesso ordine in cui sono stati aggiunti alla piastra di acclimatazione, tenendo traccia dei tempi tra i completamenti di ciascuna piastra. Sigillare la piastra con pellicola da laboratorio per ridurre al minimo la perdita di etanolo a vaporizzazione.
      6. Utilizzate un movimento di raccolta con un piccone di vermi appiattito dai bordi sottili per raccogliere i vermi sopra il piccone appiattito. Eseguire il trasferimento di vermi dalla piastra di acclimatazione non sesata alla piastra di dosaggio senza l'uso di batteri, che è comunemente usato nel trasferimento di vermi in quanto aiuta ad incollare il verme al piccone.
         NOTA: La velocità con cui gli animali vengono trasferiti in questo passaggio è molto importante perché i primi vermi sulla piastra saranno esposti all'etanolo più a lungo degli ultimi vermi aggiunti alla piastra e i punti di tempo precedenti possono mostrare alcuni effetti dipendenti dal tempo. Questa è la ragione principale per ruotare quali ceppi vengono posti prima su una piastra attraverso repliche sperimentali.
   3. Eseguire il test della locomozione: riprese
      1. Utilizzare una combinazione microscopio/fotocamera che consenta l'imaging simultaneo di tutti e quattro gli anelli nel campo visivo (circa 42x42 mm² quadrati), come un obiettivo di microscopio 0,5x, un ingrandimento di 0,8x e una fotocamera con ccd da 7,4 μm pixel 2048.
      2. Utilizzare un'illuminazione uniforme in tutto il campo visivo, che aiuta nel riconoscimento degli oggetti al passaggio di soglia di intensità. Una retroilluminazione da 3"x3" funziona bene.
      3. Immagini i vermi su una piastra posizionata sul lato del supporto verso l'alto (coperchio verso il basso), che genera un contrasto che si perde quando si utilizza la retroilluminazione rispetto a una sorgente luminosa trasmessa al microscopio tradizionale.
      4. Preparare il software di analisi delle immagini per acquisire filmati time-lapse dei worm in movimento. Impostare il software in modo che catturi immagini in scala di grigi a 12 bit ogni 1 secondo, come filmato di 2 minuti (120 fotogrammi). Per ridurre le dimensioni del file di output, pur mantenendo una risoluzione dell'immagine sufficiente, usa una modalità binning 2x2 per acquisire immagini pixel 1024x1024.
      5. Registra i film. Inizia a registrare un filmato a 120 fotogrammi della prima piastra (0 mM di etanolo) 10 minuti dopo che gli ultimi vermi sono stati posizionati su quella piastra. Salvare il file filmato.
      6. Registrare la seconda piastra (400 mM di etanolo). Ripetere questo processo per entrambe le piastre a partire da 30 minuti dopo che gli ultimi vermi sono stati posizionati sulla prima piastra (0 mM di etanolo) per catturare i punti di tempo di 30-32 minuti per ogni esposizione.
         NOTA: Concedi tempo sufficiente per salvare i file di immagine dopo ogni sessione di acquisizione prima di iniziare la registrazione della piastra successiva da analizzare.
      7. Per la verifica a prova di futuro dei film archiviati e per consentire l'apertura e l'analisi di questi film da parte di altri programmi software di imaging open source di dominio pubblico, come ImageJ, convertire una copia di ogni film in file TIFF in scala di grigi 256 a 8 bit.
         NOTA: Il software di analisi delle immagini descritto qui utilizza un formato di file proprietario.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.