Novel Tank Diving Assay: En metode til at studere medfødte stressresponser hos zebrafisk

Overview

Artiklen beskriver en adfærdsmæssig metode til at vurdere stress hos zebrafisk. Som reaktion på stress har zebrafisk tendens til at svømme i bunden af en tank, indtil stress er fjernet. Eksempelprotokollen beskriver trinvis metode til udførelse af analysen.

Protocol

1. Opsætning af nye tanktest

1. Forbered et 250 mL bægerglas fyldt med fiskesystemvand og mindst to holdetanke.
2. Om morgenen af testen overføres mindst 10 test voksne zebrafisk, der skal anvendes til hver eksperimentel tilstand (kontroller og eksperimentelle voksne) fra fiskefaciliteten til en bedriftstank, overføre dem til adfærdsrummet og give dem mulighed for at akklimatisere sig i mindst en time.
   BEMÆRK: En effektanalyse bør udføres før eksperimenter, men i vores hænder er en n = 10 normalt tilstrækkelig til at detektere statistisk signifikans. Desuden bør holdetanken ikke indeholde mere end fem personer pr. Liter vand. En akklimatisering på en time er tilstrækkelig, da zebrafisk voksne har vist sig at vænne sig inden for 30 minutter af en ny tank. Også adfærdsmæssige rytmer påvirkes af døgnrytmen processer, og dermed eksperimentelle replikater udført på forskellige dage bør udføres inden for de samme timer. Vi udfører typisk alle eksperimenter mellem kl. 11.00 og 18.00.
3. Etiketter tankene på en sådan måde, at dyrenes tilstand eller genotype er blind for forsøgsviseren.
   BEMÆRK: Eksperimenter kan let blændes til eksperimentatoren ved at mærke tanke ved hjælp af et bogstav- eller nummersystem (dvs. en tank er mærket 'A', et andet 'B' osv.). En part, der ikke er involveret i forsøgene, mærker tankene med et sådant system og maskerer identiteterne fra eksperimentatoren, indtil efter efteranalysen er afsluttet.
4. Ved hjælp af et net skal du forsigtigt placere en enkelt voksen i det forfyldte bægerglas fra trin 1.1. Lad den voksne fisk akklimatisere sig i bægeret i 10 minutter.
   BEMÆRK: Registrer den voksnes køn, da det kan være vigtigt efter analyse for at kigge efter kønsspecifikke forskelle.
5. Efter akklimatisering i bægeret skal du introducere fisken i den nye tank (opsætning af detaljer nedenfor) ved forsigtigt at hælde vandet ud og voksen fra bægeret.
   BEMÆRK: Trinene i dette afsnit beskriver opsætningen af den nye tankanalyse. Et diagram over slutproduktet findes i figur 1B.
   1. Placer den nye tank i midten af bordet.
   2. Placer de infrarøde lys bag tanken, og placer det hvide akrylark eller diffuserskærm mellem tanken og LED-lyskilden.
   3. Placer diffusoren, så den maksimalt spreder lyset, der kommer fra LED'erne, og lysets intensitet er nok til at belyse den nye tank. Jo tættere brættet er på lyskilden, jo lysere bliver lysene, men jo mindre vil det spredes. Derimod vil placering af diffusorbrættet væk fra lyskilden reducere lysintensiteten, men sprede lyset bedre.
   4. Fyld ca. tre fjerdedele af den nye tank med fiskesystemvand.
      BEMÆRK: Systemvand genereres ved hjælp af omvendt osmose af postevand, efterfulgt af dosering, således at ledningsevnen svarer til 900 ± 100 μS, at pH er neutral (7,2), og at temperaturen er 27 ± 1 °C.
   5. Sæt kameraet på kameraholderen, og kameraet til computeren. Åbn videoopsamlingssoftwaren, og juster kameraet, så det vender mod tankens forside, og sørg for, at hele den nye tank kan ses, og at der ikke er nogen skjulte områder i videoen. Juster tanken og de infrarøde lys, så der er tilstrækkelig og jævn belysning i hele tanken, når den observeres gennem kameraet.
      BEMÆRK: Før du fortsætter med eksperimenter, kan det ofte være nyttigt at udføre en prøvekørsel, hvor video af en fisk fanges, og sporing udføres. Dette sikrer, at opsætningen er tilstrækkelig til at eksperimentere med funktionsmåde.
6. Når du har introduceret den voksne i den nye tank, skal du starte kameraoptagelsen og bevæge dig væk fra opsætningen for at forhindre yderligere nød for fisken.
7. Når optagelsen er færdig, skal du fjerne personen fra den nye tank og placere den i en ny holdetank.
   BEMÆRK: En anden holdetank end den i trin 1.2 bør anvendes til at forhindre gentagne test på de samme personer.

Representative Results

Figur 1. Diagram over opsætningen af den nye tank. (A) Dimensioner af 1,8 L trapezformede nye tank set fra optagelsen side af tanken. (B) Diagram over opsætningen, herunder positioner af infrarøde lys, kamera og barrierer, der anvendes til at minimere menneskelig interferens.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology