Dit artikel beschrijft een aanpak voor zebravis netvliezen microdissect met en zonder retinale pigmentepitheel bevestigd, van een tot drie dagen postfertilization embryo's.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Microdissectie van de zebravis embryonale oogweefsels
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zebravis is een populair diermodel voor onderzoek op het oog ontwikkeling als gevolg van de snelle
Protocol
Deel 1: Voorbereidingen voor het microdissectie
- Oplossingen
- E3 medium 4 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 en 0,33 mM MgSO 4).
- Ringer-oplossing 1, 5 (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH7.2), filter gesteriliseerd.
- 5N NaOH.
- Chemisch etsen van wolfraam naalden
- Secure een klein bekerglas met 5N NaOH op een petrischaaltje met klei.
- Bevestig een paperclip aan de kant van de beker, zodat het in contact komt met de NaOH-oplossing.
- Sluit de negatieve elektrode van een DC-voeding n....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Microdissectie van de zebravis oogweefsels effectief kan krijgen intact netvlies en de RPE-aangesloten netvlies. Dit helpt aanzienlijk expressie studies met betrekking tot een specifieke oogweefsel (dat wil zeggen het netvlies of RPE). In feite hebben we met succes gebruik gemaakt van deze procedures om RNA-expressie profielen te verkrijgen van de hele retina 1 en RPE 3. Het nut van deze profielen wordt sterk ondersteund door onze recente identificatie van paden en gen-families die worden verstoord.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door Purdue Animal Care en gebruik Comite.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door een startup fonds van de afdeling Biologische Wetenschappen aan de Purdue University.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Draadloze stampermotor | VWR international | 47747-370 | |
| Gelijkstroomvoeding | Lascar | PSU130 | Elke DC-voeding zou werken. De specifieke spanning van een andere machine zal verder geoptimaliseerd moeten worden. |
| Wegwerpstamper µcentrifugebuis, 1,5 mL (DNase-, RNase- en pyrogeenvrij) | VWR international | 47747-366 | Deze worden gebruikt voor het verzamelen van weefsel in TRIzol voor expressieanalyse. |
| Dumont #5 pincet, Punten: 0,05 x 0,01 mm, Inox | World Precision Instruments, Inc. | 500341 | Een fijne tipdimensie is wenselijk, maar is niet strikt vereist, aangezien de tip van tijd tot tijd mogelijk moet worden aangescherpt. |
| Dumont #5SF pincet, punten: 0,025 x 0,005 mm, Inox | Fine Science Tools | 11252-00 | De afmeting van de fijne punt is wenselijk, maar niet strikt vastgelegd, aangezien de punt af en toe geslepen moet worden. |
| Falcon polystyreen kweekplaten, 60 X 15 mm | BD Biosciences | 351007 | Deze platen worden gebruikt als dissectieplaten. |
| Olympus SZX16 stereomicroscoop | Olympus Corporation | SZX16 | Elke stereomicroscoop is geschikt. In eerdere studies hebben wij een Leica stereomicroscoop gebruikt.1-3 zonder problemen. We gebruiken bovendien uitsluitend het 1X-objectief voor de dissectie, ook al is er een 2X-objectief geïnstalleerd. |
| Slijpsteen | Fine Science Tools | 29008-01 | Gebruik dit indien nodig om de punt van de pincet te slijpen |
| Thermoplaat | Tokai Hit | MATS-U55SZX2B | Dit wordt gebruikt om de temperatuur van het weefsel tijdens de dissectie constant te houden en de invloed van temperatuurschommelingen op de genexpressie te minimaliseren. We hebben de gehele microscoop bovendien geplaatst in een geconditioneerde ruimte op 28°C.°C tijdens dissectie in eerdere studies1-3 met succes. |
| Trizol, 100 mL | Invitrogen | 15596-026 | |
| wolfraamdraad, 0,015 inch diameter | World Precision Instruments, Inc. | TGW1510 | |
| Houten applicator | Puritein | 807 | Dit wordt gebruikt voor het vasthouden van de chemisch geëtste wolfraamnaald. |
Referenties
- Leung, Y. F., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina. Zebrafish. 2, 269-283 (2005).
- Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
