Ce protocole décrit comment la chromatine immunoprécipitation (ChIP) est utilisée pour étudier les altérations dynamiques du modèle de la chromatine qui régulent la transcription induite par une voie de transduction du signal.
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Article de méthode
Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans l'expression génique dans les cellules humaines Activé
Dans cet article
Résumé
Résumé
En réponse à une variété de ligands extracellulaires, la STAT (transducteur de signal et activateur de la transcription) des facteurs de transcription sont rapidement recrutés dans leur état latent dans le cytoplasme aux récepteurs de surface cellulaire où ils sont activés par la phosphorylation d'un seul résidu tyrosine 1. Ils ont ensuite dimériser et translocation vers le noyau de conduire la transcription de gènes cibles, affectant la croissance, la différenciation, l'homéostasie et la réponse immunitaire. Il n'est pas surprenant, étant donné leur implication dans les processus généralisé de cellules normales, dérèglement de la fonction STAT contribue à la maladie humaine, en particulier pour les cancers et les maladies auto-immunes 2 3.
Il est bien établi que la transcription est régulée par des modifications au modèle de la chromatine 4,5. Ces modifications comprennent les activités de l'ATP-dépendant de complexes, ainsi que covalentes modifications des histones et la méthylation de l'ADN 6. Parce que l'activation de l'expression génique STAT est à la fois rapide et transitoire, elle nécessite des mécanismes spécifiques permettant de moduler le modèle chromatine au locus du gène STAT-dépendante. Pour définir ces mécanismes, nous caractérisons les modifications des histones et les activités enzymatiques qui les génèrent à des loci génétiques qui répondent à STAT. Ce protocole décrit immunoprécipitation de la chromatine, une méthode qui est précieux pour l'étude de la STAT à la chromatine dans l'expression des gènes activés.
Protocole
PLANIFICATION
La veille d'une expérience de ChIP est prévu, les cellules doivent être cultivées de sorte qu'un nombre suffisant est disponible. Supposons que chaque dosage, il faudra ChIP ~ 1 à 1,5 x 10 7 cellules. Prévoyez toujours de faire les deux contrôles négatifs (IgG) et positifs (anticorps pan histones) et des expériences en double.
Astuce - Pour les cellules 2FTGH, chaque dosage puce nécessite environ une boîte de culture 15 cm de tissu à 80% de confluence.
PARTIE 1: PRÉPARER ET EFFECTUER CHROMATINE ChIP
- Retirez les milieux de culture et d'induire les cellules....
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Discussion
Le protocole décrit ChIP a été utilisé avec succès dans le laboratoire d'essai de plus de vingt différentes modifications des histones. En outre, nous avons caractérisé les changements dans l'occupation des facteurs de transcription, enzymes de modification des histones, protéines qui reconnaissent modifications des histones et la transcription de l'ARN polymérase II machines, à l'IFN-γ de plusieurs gènes induits. Nous avons également utilisé la procédure de caractériser les changements dans les modifica.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail est soutenu par l'Université de Virginie, l'Université de Virginie Cancer Center et The F. Thomas et Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Nous remercions le James E. Darnell Lab (Rockefeller University), le Laboratoire de Robert Ross (Université Fordham) pour les lignées cellulaires.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Formaldéhyde à 37 % | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroforme/alcool isoamylique | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Inhibiteurs complets de protéase, format mini | Roche Group | 1836153 | |
| Sérum de veau cosmique | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Éthanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogène | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Acétate de sodium | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Chlorure de désoxycholate de sodium | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phénol/chloroforme/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Protéinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| ARNase A | 5 PRIME | 2500130 | |
| ADN de sperme de saumon/agarose liée à la protéine A | EMD Millipore | 16-157 | |
| ADN de sperme de saumon/agarose liée à la protéine G | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-ARN polymérase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
Références
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on ....
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Réimpressions et autorisations
