Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे chromatin immunoprecipitation (चिप) chromatin टेम्पलेट है कि एक संकेत transduction मार्ग से प्रेरित प्रतिलेखन विनियमित करने के लिए गतिशील परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Abstract
कोशिकी ligands की एक किस्म के जवाब में, स्टेट (संकेत और प्रतिलेखन के transducer उत्प्रेरक) प्रतिलेखन कारक तेजी से कोशिका की सतह रिसेप्टर्स जहां वे phosphorylation द्वारा एक एकल एक tyrosine अवशेषों पर सक्रिय कर रहे हैं के लिए कर रहे हैं उनके cytoplasm में अव्यक्त राज्य से भर्ती है. वे तो dimerize और नाभिक को टसकाना लक्ष्य जीन प्रतिलेखन ड्राइव, विकास, भेदभाव, homeostasis और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित. आश्चर्य नहीं कि उनके सामान्य कोशिका प्रक्रिया में व्यापक भागीदारी को देखते हुए, स्टेट समारोह की dysregulation मानव रोग के लिए योगदान देता है विशेष रूप से 2 कैंसर और autoimmune बीमारियों 3.
यह अच्छी तरह से स्थापित है कि प्रतिलेखन परिवर्तन द्वारा chromatin 4,5 टेम्पलेट के लिए विनियमित है. ये परिवर्तन एटीपी निर्भर परिसरों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सहसंयोजक histone संशोधनों और डीएनए मेथिलिकरण 6 की गतिविधियों में शामिल हैं. क्योंकि जीन अभिव्यक्ति के स्टेट सक्रियण दोनों तेजी से और क्षणिक है, यह modulating स्टेट निर्भर जीन loci में chromatin टेम्पलेट के लिए विशिष्ट तंत्र की आवश्यकता है. इन तंत्रों को परिभाषित करने के लिए, हम histone संशोधनों और enzymatic गतिविधियों है कि उन्हें जीन loci कि स्टेट संकेत के लिए जवाब में उत्पन्न विशेषताएँ. इस प्रोटोकॉल chromatin immunoprecipitation, एक तरीका है कि स्टेट सक्रिय जीन अभिव्यक्ति में chromatin संकेत के अध्ययन के लिए मूल्यवान है का वर्णन करता है.
Protocol
योजना
दिन से पहले एक चिप के प्रयोग की योजना बनाई है, कोशिकाओं सुसंस्कृत हो सकता है ताकि एक पर्याप्त संख्या में उपलब्ध है चाहिए. मान लें कि प्रत्येक चिप परख 1-1.5 ~ 10 x 7 कोशिकाओं की आवश्यकता होगी. हमेशा के लिए दोनों नकारात्मक आईजीजी () और सकारात्मक (पैन histone एंटीबॉडी) नियंत्रण और डुप्लिकेट प्रयोगों की योजना है.
टिप - 2FTGH कोशिकाओं के लिए, प्रत्येक चिप परख 80% confluency पर एक के बारे में 15 सेमी टिशू कल्चर पकवान की आवश्यकता है.
भाग 1: chromatin तैयार करने और चिप प्रदर्शन
- संस्कृति मीडिया निकालें और 10% ब्रह्मांडीय बछड़ा सीरम (सीसीएस) / 5 एनजी एमएल / IFN गामा युक्त DMEM के 20 एमएल के साथ आवश्यक समय के लिए कोशिकाओं को उत्पन्न. Uninduced प्लेटों पर मीडिया / सीसीएस DMEM में अच्छी तरह के रूप में 10% की 20 एमएल के साथ बदलें.
- एक धूआं हुड में, मीडिया के 15 सेमी डिश में 20 (1% अंतिम एकाग्रता) एमएल 540 μL 37% formaldehyde जोड़ें.
घुमाएँ थाली और मीडिया पूल के लिए formaldehyde के जोड़ - युक्ति तब रॉक थाली करने के लिए समान रूप से फैला. - Crosslinking के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें.
- 0.125 एम अंतिम एकाग्रता ग्लाइसिन जोड़ें crosslinking रोक.
- मीडिया aspirate वैक्यूम और कोशिकाओं को 10 एमएल बर्फ ठंड फॉस्फेट के साथ एक बार धोने buffered खारा (पीबीएस).
- ~ 7 एमएल पीबीएस में एक सेल खुरचनी के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा करने और गठबंधन (6 प्लेटों से) कोशिकाओं है कि बर्फ पर 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में हूबहू इलाज किया गया.
- 4 में 1800 rpm पर (Beckman Coutler 12 आर Allegra अपकेंद्रित्र) अपकेंद्रित्र ° 5 मिनट के लिए सी और PBS aspirate.
युक्ति - स्नैप फ्रीज सेल गोली अगर सी. यहाँ रोक और -80 पर दुकान ° - Resuspend 4 एमएल सूजन बफर (25 मिमी 7.8 पीएच HEPES, 1.5 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी KCl, 0.1% NP40. 1 मिमी डीटीटी, पूरा protease inhibitors और बर्फ पर पहले सर्द उपयोग करने के लिए जोड़ें) में सेल गोली और एक 15 के लिए स्थानांतरण एमएल शंक्वाकार ट्यूब.
टिप - यह सूजन बफर मात्रा एक 6 थाली पूलिंग (~ 6-9 x 10 7 कोशिकाओं) के लिए उपयुक्त है . कम या ज्यादा बफर douncing दक्षता बदल सकता है. - 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेल निलंबन सेते हैं.
- स्थानांतरण एक पूर्व ठंडा 15 एमएल douncer Wheaton () के लिए निलंबन और मूसल ए के साथ 20 स्ट्रोक dounce
- स्थानांतरण कोशिकाओं वापस बर्फ पर एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब dounced.
- 4 में 5 मिनट के लिए 2500 rpm पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- Resuspend 3 एमएल में परमाणु (6 प्लेटों से ~ 200 μL) गोली (15 गोली संस्करणों) Sonication बफर (50 मिमी HEPES 7.9 पीएच, 140 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 1% Triton एक्स-100, 0.1% सोडियम deoxycholate, एसडीएस 0.1% बर्फ पर पूरा protease inhibitors और ठंड से ठीक पहले जोड़ें का उपयोग करने के लिए).
टिप - यह sonication बफर मात्रा 6 थाली पूलिंग (~ 6-9 x 10 7 कोशिकाओं) के लिए उपयुक्त है . कम या ज्यादा बफर sonication दक्षता बदल सकता है. - बर्फ पर 10 चक्र (20 सेकंड on/40 बंद आयाम / 8 की स्थापना सेकंड) Misonix 3000 Sonicator microtip के साथ सुसज्जित का उपयोग के लिए नाभिक निलंबन Sonicate. यह chromatin 200-1000 आकार में बीपीएस औसत टुकड़े में आमतौर पर परिणाम.
टिप - क्योंकि sonicators अलग अलग होंगे, sonication दक्षता empirically निर्धारित किया जाना चाहिए. ऐसा करने के लिए, sonication से पहले और प्रत्येक sonication चक्र के बाद 20 μL की aliquots ले. 4 घंटे के लिए 65 ° सी में इन नमूनों हीट. डीएनए लोड हो रहा है बफर जोड़ें और एक मानक% 1 / agarose TBE डीएनए टुकड़े कल्पना जेल चलाते हैं.) - स्थानांतरण 4 बजे 20 मिनट के लिए एक SS34 अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए सामग्री sonicated ° एक SS34 रोटर में 13000 rpm (RC6 Sorvall प्लस अपकेंद्रित्र) पर गोली सी जो आमतौर पर सेल मलबे की एक छोटी राशि है.
- ध्यान से बर्फ पर एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण.
- पूर्व 360 μL सामन शुक्राणु डीएनए प्रोटीन / A या जी agarose मोती घोल जोड़ने और कम से कम 30 मिनट के लिए 4 ° C पर कमाल के द्वारा स्पष्ट है.
टिप - यह कदम परख है कि गैर विशिष्ट बंधनकारी घटनाओं से उठता में शोर घट जाती है . - 4 ° C से कम 1000 rpm पर गोली agarose मोती के लिए 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- एक और 15 एमएल बर्फ पर शंक्वाकार ट्यूब करने के लिए सतह पर तैरनेवाला पूर्व मंजूरी दे दी स्थानांतरण.
- Chromatin पूर्व मंजूरी दे दी A260 इकाइयों उपाय और Sonication बफर के साथ चार (4) A260 इकाइयों (0.2 मिलीग्राम / एमएल 1 A260 इकाई = 0.050 मिलीग्राम / एमएल संभालने) के लिए मात्रा समायोजित करें
190 μL DDW में 10 μL sonication बफर के साथ खाली; स्पेक्ट्रोफोटोमीटर - युक्ति A260 इकाइयों को मापने, 190 μL DDW में पूर्व मंजूरी दे दी है chromatin के 10 μL पतला. - इनपुट नमूना और दुकान के रूप में 20 chromatin की 75 μL (4 A260 इकाइयों पर) सहेजें डिग्री सेल्सियस तक crosslinks रिवर्स करने के लिए तैयार है.
टिप - यह डेटा विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण कदम है . इनपुट विभाज्य लेने की उपेक्षा मत करो. - विभाज्य मैं पर 1.7 एमएल microfuge ट्यूबों के लिए तैयार है chromatinCE के 1 एमएल aliquots के रूप में.
टिप - अगर यहाँ रोक -80 पर सूखी बर्फ और दुकान पर तैयार chromatin स्थिर तस्वीर डिग्री सेल्सियस एनबी: संग्रहीत chromatin नीचा, इष्टतम परिणामों की तुलना में कम उत्पादन कर सकते हैं, इसलिए से बचने के यदि संभव हो तो. - प्रेरित और uninduced नमूने चिप ग्रेड एंटीबॉडी जोड़ें दो प्रतियों में सेट है. (2 μg) आईजीजी और पैन histone H3 एंटीबॉडी (15 μL) को प्रेरित किया और uninduced नमूने सेट करने के लिए नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में जोड़ें.
टिप - एंटीबॉडी की राशि का उपयोग करने के लिए empirically निर्धारित किया जाना चाहिए या सुझाव दिया मात्रा के लिए आपूर्तिकर्ता उत्पाद चादर देखें. एक चिप ग्रेड एंटीबॉडी के 1-2 μg आमतौर पर अच्छी तरह से काम करता है. एंटीबॉडी कि सीरम के रूप में सप्लाई कर रहे हैं के लिए उपयुक्त मात्रा empirically निर्धारित करना चाहिए. - सभी ट्यूबों 4 में रातोंरात रॉक डिग्री सेल्सियस
भाग 2: IMMUNOCOMPLEXES इकट्ठा
- सभी ट्यूबों के सामन शुक्राणु / प्रोटीन डीएनए एक या प्रोटीन जी agarose मोती घोल का 60 μL जोड़ें.
युक्ति का प्रयोग करें प्रोटीन खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी और माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए और प्रोटीन जी के लिए. - 4 ° C पर कम से कम 60 मिनट के लिए रॉक.
- गोली 4 में 2000 rpm पर धीरे microfuging द्वारा (agarose मोती) immunocomplexes ° सी 3 मिनट के लिए.
- सतह पर तैरनेवाला Aspirate.
- 4 डिग्री सेल्सियस कमाल के साथ प्रत्येक के 10 मिनट के लिए निम्नलिखित धो Buffers 1 एमएल के साथ immunocomplexes धो 2000 rpm पर 3 मिनट के लिए 4 Microfuge ° सी प्रत्येक धोने और aspirate सतह पर तैरनेवाला के बीच. बर्फ पर ठंडा नमूने रखें. PMSF सिर्फ पहले जोड़ें उपयोग करने के लिए.
- कम नमक धो - 0.1% एसडीएस, ट्राइटन% 1 एक्स-100, 2 मिमी EDTA, 20 Tris सीएल मिमी, 8.0 पीएच, 150 मिमी NaCl, 1 मिमी PMSF
- उच्च नमक धो - 0.1% एसडीएस, ट्राइटन% 1 एक्स 100, 2 मिमी EDTA, 20 Tris-सीएल, पीएच 8.0 मिमी, 500 मिमी NaCl, 1 मिमी PMSF
- LiCl धो - 0.25 एम LiCl, 1 एनपी 40%, 1% सोडियम deoxycholate, 1 मिमी EDTA, 10 Tris सीएल मिमी, 8.0 पीएच, 1 मिमी PMSF
- ते धो ते बफर Tris-सीएल -10 मिमी, 8.0 पीएच, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी PMSF के साथ दो Washes
- अंतिम ते बफर धोने निकालें और मोती, 500 μL Elution बफर (50 मिमी Tris - सीएल, 8.0 पीएच, 10 मिमी EDTA, 1% एसडीएस) जोड़ें.
टिप - Elution बफर हौसले से तैयार किया जाना चाहिए. - 65 में agarose मोती Elution बफर और गर्मी में 30 मिनट के लिए मिश्रण भंवर डिग्री सेल्सियस
युक्ति - भंवर प्रत्येक ट्यूब इस 30 मिनट के दौरान कम से कम हर 10 मिनट . - Microfuge 2000 rpm पर 30 सेकंड के लिए और एक नया microfuge ट्यूब eluent हस्तांतरण.
टिप - elution के दौरान, आपके इनपुट के नमूने का पिघलना और हर एक के लिए 500 μL Elution बफर जोड़ने. सभी चरणों में आगे जा रही इन नमूनों को शामिल करें. - सभी नमूनों और भंवर को 200 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 5 एम NaCl जोड़ें.
- 65 में सेते डिग्री सेल्सियस रातोंरात (या कम से कम 4 घंटे).
भाग 3: शुद्ध ChIP'd और निवेश डीएनए
- 30 सेकंड के लिए lids पर संक्षेपण इकट्ठा सभी नमूनों Microfuge.
- प्रत्येक ट्यूब और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते RNase ए की 1μL (10 यू / μL) जोड़ें.
- 10 μL 0.5 एम EDTA, 40 μL 0.5 एम Tris सीएल पीएच 6.5, 2 μL proteinase कश्मीर (10 मिलीग्राम / एमएल) और 45 पर सेते ° C 60 मिनट के लिए जोड़ें. युक्ति इन अभिकर्मकों के एक मास्टर मिश्रण तैयार करें और प्रत्येक ट्यूब करने के लिए 52 μL जोड़ने.
- Phenol / / क्लोरोफॉर्म isoamyl शराब और फिर क्लोरोफॉर्म / isoamyl शराब निकालने के नमूने निकाल सकते हैं.
- 2 μL ग्लाइकोजन (25 μg / μL) और 3M ना एसीटेट 5.2 पीएच और भंवर के 0.1 संस्करणों जोड़ें.
- 100% इथेनॉल और भंवर के 2.5 मात्रा जोड़ें.
- 20 में डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.
भाग 4: शुद्ध ChIP'd और निवेश डीएनए जारी
- 13,000 rpm पर 4 बजे 20 मिनट की एक न्यूनतम के लिए Microfuge नमूनों डिग्री सेल्सियस डीएनए / ग्लाइकोजन छर्रों वेग.
- 70% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ डीएनए / ग्लाइकोजन छर्रों के साथ धोएं.
- एयर सूखी या छर्रों डीएनए सावंत गति वैक्यूम अपकेंद्रित्र में जल्दी सूख.
टिप - क्या डीएनए पर सूखी नहीं. - 200 μL ते बफर में डीएनए / ग्लाइकोजन छर्रों Resuspend.
- डीएनए (1 μL) वास्तविक समय पीसीआर के माध्यम से मात्रा का ठहराव के लिए तैयार है. स्टोर 20 में शेष डीएनए डिग्री सेल्सियस
युक्ति - डीएनए की अधिक से अधिक 1 μL का उपयोग वास्तविक समय पीसीआर प्रतिक्रियाओं को बाधित कर सकते हैं, इसलिए सावधानी के साथ पैमाने .
भाग 5: प्रतिनिधि परिणामों:
चिप और इनपुट के डीएनए नमूने के साथ वास्तविक समय पीसीआर 7,8 (एप्लाइड Biosystems 7500 फास्ट वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम) ब्याज की जीन ठिकाना विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. प्राइमर्स कि लक्ष्य जीनोमिक अनुक्रम में जाना जाता है में हो समृद्ध करने के लिए या जा रहा है assayed histone संशोधनों में कमी के रूप में अच्छी तरह से सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. डेटा इनपुट के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत किया है. चिप प्रक्रिया पूर्ण होना चाहिए rतीन के साथ epeated जैविक histone संशोधनों में रिपोर्ट परिवर्तन सांख्यिकीय महत्वपूर्ण हैं सुनिश्चित replicates.
वहाँ कई महत्वपूर्ण मुद्दों पर विचार करने के लिए जब वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करने के लिए डीएनए प्राइमर डिजाइन, पीसीआर, दक्षता, और इनपुट और सामान्य प्रक्रियाओं के प्रतिशत की गणना के लिए एक उपयुक्त रास्ता सहित, यों कर रहे हैं. जब एक जीन भर histone संशोधन अधिभोग रूपरेखा, पीसीआर दक्षता सभी प्राइमर जोड़े के बीच संगत होना चाहिए. वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली के निर्माता आवश्यक जानकारी और प्रशिक्षण प्रदान कर सकते हैं.
चित्रा 1 से पता चलता है chromatin के प्रतिनिधि परिणाम IRF1 9 जीन की STAT1 सक्रियण के दौरान immunoprecipitated, IFN- γ चालू है.
चित्रा 1. STAT1, शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय और H3K36me3 की रिहाइश IRF1 जीन की STAT1 सक्रियण के दौरान गतिशील है . (ए, बी, सी) α H3K36me3, α-STAT1 और α पोल chromatin के द्वितीय 2FTGH कोशिकाओं से एकत्र के साथ चिप के साथ IFN-γ (30 मिनट (लाल वर्गों), 1.5 घंटे (नीले हलकों), 5 घंटे प्रेरित हरे रंग का) त्रिकोण या uninduced (काले हीरे). आईजीजी नकारात्मक नियंत्रण (ग्रे पार) (डी) पान H3 सकारात्मक नियंत्रण है और प्रेरित (नीले हलकों) में ठिकाना भर histone अधिभोग और uninduced शर्तों (काले हीरे) से पता चलता है. -5 बीपी आसपास डुबकी nucleosome रिक्तीकरण है कि प्रतिलेखन शुरू स्थलों पर पाया जाता है की वजह से है.
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Discussion
चिप उल्लिखित प्रोटोकॉल बीस से अधिक विभिन्न histone संशोधनों की परख के लिए प्रयोगशाला में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया. इसके अलावा, हम प्रतिलेखन कारकों के अधिभोग में परिवर्तन की विशेषता है, histone संशोधित एंजाइमों, प्रोटीन, कि histone संशोधनों और शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय प्रतिलेखन मशीनरी पहचान कई IFN-γ प्रेरित जीन पर. हम भी प्रक्रिया का इस्तेमाल किया है एक कैंसर स्टेम सेल 10 के भेदभाव के दौरान histone संशोधनों में परिवर्तन विशेषताएँ .
चिप डेटा की गुणवत्ता के अंत में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की प्रभावशीलता पर निर्भर करता है और एंटीबॉडी के बीच काफी परिवर्तनशीलता है. विफलता के लिए एक संशोधन चिप, इसलिए, मतलब ने कहा कि संशोधन मौजूद नहीं है नहीं किया जा व्याख्या कर सकते हैं. इसके अलावा, एक विशेष चिप प्रयोग में मनाया संशोधन में परिवर्तन बस पास के अवशेषों पर अतिरिक्त histone संशोधनों की वजह से एंटीबॉडी द्वारा मिलान की मान्यता में एक बदलाव को प्रतिबिंबित कर सकते हैं. इसलिए, चिप परिणाम दृष्टिकोण है कि एक histone संशोधन में मनाया परिवर्तन एक जैविक परिणाम से संबंधित के साथ मान्य होना चाहिए. जब यह किया जाता है, चिप chromatin आधारित तंत्र है कि जीन अभिव्यक्ति के नियमन में योगदान के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली तरीका है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम वर्जीनिया विश्वविद्यालय, वर्जीनिया कैंसर केंद्र के विश्वविद्यालय और थॉमस एफ और केट मिलर Jeffress मेमोरियल ट्रस्ट द्वारा समर्थित है. हम जेम्स ई. Darnell लैब (रॉकफेलर विश्वविद्यालय) रॉबर्ट रॉस लैब (Fordham विश्वविद्यालय) सेल लाइनों के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Ethanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
References
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