Summary
Этот протокол описывает, как хроматин иммунопреципитации (чип) используется для изучения динамических изменений хроматина шаблон, который регулирует транскрипцию индуцированных пути передачи сигнала.
Abstract
В ответ на различные внеклеточные лиганды, STAT (преобразователь сигнала и активатор транскрипции) транскрипционные факторы быстро набираются из своего латентного состояния в цитоплазму, чтобы рецепторами клеточной поверхности, где они приводятся в действие фосфорилирования в одной остаток тирозина 1. Затем они димеризуются и транслокации в ядро для управления транскрипцию генов-мишеней, влияющих на рост, дифференцировку, гомеостаза и иммунного ответа. Не удивительно, учитывая их широкое вовлечение в нормальных клеточных процессов, нарушение регуляции функции STAT способствует болезни человека, в частности, рака 2 и аутоиммунных заболеваний 3.
Хорошо известно, что транскрипции регулируется изменений хроматина шаблон 4,5. Эти изменения включают деятельность АТФ-зависимых комплексов, а также ковалентные модификации гистонов и метилирования ДНК 6. Потому что СТАТ активации экспрессии генов является одновременно быстрый и преходящее, она требует конкретных механизмов для модуляции хроматина шаблон на STAT-зависимых локусы генов. Чтобы определить эти механизмы, мы характеризуем модификации гистонов и ферментативных активностей, которые их в генных локусов, которые отвечают на STAT сигнализации. Этот протокол описывает хроматин иммунопреципитации, метод, который является ценным для изучения СТАТ сигнализации с хроматином в активированных экспрессии генов.
Protocol
ПЛАНИРОВАНИЕ
Накануне ChIP эксперимента планируется, камеры должны быть культурными, так что их достаточное число. Предположим, что каждый чип анализа потребуется ~ 1-1,5 х 10 7 клеток. Всегда планирую сделать как отрицательное (IgG) и положительных (панорамирование гистонов антитело) управления и дублировать эксперименты.
Совет - Для 2FTGH клеток, каждый чип анализ требует около 15 см культуре ткани блюдо на 80% слияния.
ЧАСТЬ 1: Подготовка ХРОМАТИНА и выполнять ChIP
- Удалить культуру средств массовой информации и вызывают клеток для раз требуется 20 мл 10% космических телячьей сыворотки (CCS) / DMEM содержащие интерферон-гамма в 5 нг / мл. Замените СМИ uninduced пластин с 20 мл 10% CCS / DMEM, а также.
- В вытяжной шкаф, добавить 540 мкл 37% формальдегида в 20 мл среды (1% конечная концентрация) в 15 см блюдо.
Совет - Tilt тарелку и добавить формальдегид в пул носителей - то каменную плиту, чтобы распространить ее равномерно. - Разрешить сшивания проводили в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Добавить глицина до 0,125 М конечной концентрации, чтобы остановить сшивания.
- Вакуумная аспирация СМИ и промыть клетки один раз с 10 мл ледяной фосфатным буферным раствором (PBS).
- Сбор клетки с клеткой скребок в ~ 7 мл PBS и объединить клетки (из 6 пластин), которые лечились одинаково в 50 мл коническую трубку на льду.
- Центрифуга (Beckman Coutler Allegra 12-R Центрифуга) при 1800 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 5 минут и аспирации PBS.
Совет - Snap заморозить осадок клеток, если остановка здесь и хранить при температуре -80 ° C. - Ресуспендируют осадок клеток в 4 мл Отек буфера (25 мМ HEPES рН 7,8, 1,5 мМ MgCl 2, 10 мМ KCl, 0,1% NP40. Добавить 1 мМ DTT, Полная ингибиторов протеазы и холод на лед перед использованием) и трансфер в 15 мл коническую трубку.
Совет - это отек объем буфера подходит для 6 пластин объединения (~ 6-9 х 10 7 клеток). Более или менее буфера может измениться douncing эффективности. - Инкубируйте клеточной суспензии на льду в течение 10 минут.
- Передача подвески предварительно охлажденное 15 мл douncer (Уитон) и Dounce 20 ударов с пестиком А.
- Передача dounced клетки обратно в 15 мл коническую трубку на льду.
- Центрифуга при 2500 оборотов в минуту в течение 5 минут при 4 ° С и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют ядерной гранул (~ 200 мкл из 6 пластин) в 3 мл (15 гранул объемов) ультразвуком буфера (50 мМ HEPES рН 7,9, 140 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон Х-100, 0,1% натрия дезоксихолатом, 0,1% SDS. Добавить Полное ингибиторов протеазы и холод на лед непосредственно перед использованием).
Совет - Этот объем буфера ультразвуком подходит для 6 пластин объединения (~ 6-9 х 10 7 клеток). Более или менее буфера может измениться ультразвуком эффективности. - Разрушать ультразвуком ядер подвески на льду в течение 10 циклов (20 секунд on/40 секунд выкл / амплитуда установка 8), используя Sonicator Misonix 3000 оснащен микроострийных. Это обычно приводит фрагменты хроматина среднем 200-1000 бит в размерах.
Совет - Потому что sonicators будет меняться, ультразвука эффективность должна определяться опытным путем. Чтобы сделать это, возьмите аликвоты 20 мкл до ультразвука и после каждого цикла обработки ультразвуком. Тепло этих образцов при температуре 65 ° С в течение 4 часов. Добавить буфера ДНК загрузки и запуска стандартного 1% агарозном / TBE геля для визуализации фрагментов ДНК.) - Передача ультразвуком материал для SS34 центрифужную пробирку и центрифуги в течение 20 минут при 4 ° С при 13000 оборотов в минуту в SS34 ротора (Sorvall RC6 Плюс центрифуги) в гранулах, что, как правило, небольшое количество клеточного мусора.
- Тщательно передачи супернатант в 15 мл коническую трубку на льду.
- Предварительно ясно, добавив 360 мкл ДНК спермы лосося / Белок или G агарозном бисером шлама и качалки при 4 ° С в течение не менее 30 минут.
Совет - Этот шаг уменьшается шум в анализе, которое возникает из неспецифического связывания событий. - Центрифуга при 1000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 5 минут, чтобы гранулы агарозном бисером.
- Передача предварительно очищен супернатант в другой 15 мл коническую трубку на льду.
- Мера A260 единиц предварительно очищен хроматина и регулировать громкость с помощью ультразвука буфера до четырех (4) A260 единиц (0,2 мг / мл, предполагая 1 A260 единица = 0,050 мг / мл)
Совет - Для измерения A260 единиц, развести 10 мкл предварительно очищен хроматина в 190 мкл DDW; пустой спектрофотометр с 10 мкл буфера ультразвука в 190 мкл DDW. - Сохранить 75 мкл хроматина (при 4 A260 шт.) в Пример входных данных и храните при температуре 20 ° С до готовности отменить сшивки.
Совет - Этот шаг имеет решающее значение для анализа данных. Не пренебрегайте принять входной аликвоту. - Алиготе подготовлены хроматина до 1,7 мл пробирок микроцентрифужную на ясе, как 1 мл аликвоты.
Совет - Если остановка здесь, оснастки заморозить подготовлены хроматина на сухом льду и хранить при температуре -80 ° C. NB: хранить хроматина может привести к снижению, производя меньше, чем оптимальные результаты, поэтому следует избегать, если это возможно. - Добавить ChIP класса антител к индуцированных и uninduced образцы наборов в двух экземплярах. Добавить IgG (2 мкг) и пан гистонов H3 антитела (15 мкл), а отрицательные и положительные элементы управления для индуцированных и uninduced образцы наборов.
Совет - количество антител использовать, должен быть определен эмпирически или смотрите лист поставщика для предлагаемых сумм. Обычно 1-2 мкг ChIP класса антител, работает хорошо. Соответствующий объем должен быть определен эмпирически для антител, которые поставляются в сыворотке крови. - Рок все трубы на ночь при 4 ° C.
ЧАСТЬ 2: COLLECT иммунных
- Добавить 60 мкл ДНК спермы лосося / белка или белка G суспензии агарозы бисера для всех трубок.
Белки Совет Используйте для кролика поликлональных антител и белков G для мышиных моноклональных антител. - Рок при 4 ° С в течение не менее 60 минут.
- Гранул иммунных комплексов (агарозном бусы) по microfuging мягко при 2000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 3 минут.
- Аспирируйте супернатант.
- Вымойте иммунных комплексов с 1 мл каждого из следующих буферов вымойте в течение 10 минут с качающимися при 4 ° C. Микроцентрифужную в течение 3 минут при 2000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C между каждой стирки и аспирации супернатант. Храните образцы охлажденной на льду. Добавить PMSF непосредственно перед использованием.
- Низкий Вымойте соль - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ EDTA, 20 мМ Трис-Cl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ PMSF
- Высокая Вымойте соль - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ EDTA, 20 мМ Трис-Cl, рН 8,0, 500 мМ NaCl, 1 мМ PMSF
- LiCl Wash - 0,25 М LiCl, 1% NP-40, 1% натрия дезоксихолата, 1 мМ EDTA, 10 мМ Трис-Cl, рН 8,0, 1 мМ PMSF
- TE Wash - ДВА Моет с TE буфера -10 мМ Трис-Cl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF
- Удалить окончательного буфера TE мыть и бусы, добавить 500 мкл буфера элюции (50 мМ Трис-Cl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 1% SDS).
Совет - элюции буфера должны быть готовы свежие решения. - Vortex смешать агарозном бусины буфера элюции и тепла в течение 30 минут при температуре 65 ° C.
Совет - вихрь каждую пробирку по крайней мере каждые 10 минут в течение этого 30 минут. - Микроцентрифужную в течение 30 секунд при 2000 оборотах в минуту и передачи элюента в новую пробирку и отцентрифугировать.
Совет - Во время элюирования, оттепель ваши образцы входных и добавить 500 мкл буфера элюции для каждого из них. Включите эти образцы на всех этапах продвижения вперед. - Добавьте 5 М NaCl до конечной концентрации 200 мМ для всех образцов и вихря.
- Инкубировать при 65 ° С в течение ночи (или по крайней мере 4 часа).
ЧАСТЬ 3: очистить ChIP'd И ВВОД ДНК
- Микроцентрифужную всех образцов в течение 30 секунд для сбора конденсата на крышках.
- Добавить 1 мкл РНКазы (10 ед / мкл) в каждую пробирку и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
- Добавьте 10 мкл 0,5 М ЭДТА, 40 мкл 0,5 М Трис-Cl рН 6,5, 2 мкл протеиназы К (10 мг / мл) и инкубируют при 45 ° С в течение 60 минут. Совет Подготовка мастер сочетание этих реагентов и добавить 52 мкл в каждую пробирку.
- Фенол / хлороформ / изоамиловый спиртовой экстракт, а затем хлороформ / изоамиловый спиртовой экстракт образцов.
- Добавьте 2 мкл гликогена (25 мкг / мкл) и 0,1 объемов 3М ацетата натрия рН 5,2 и вихря.
- Добавить 2,5 объемами 100% этанола и вихря.
- Инкубировать при 20 ° С в течение ночи.
ЧАСТЬ 4: очистить ChIP'd И ВВОД ДНК ПРОДОЛЖЕНИЕ
- Микроцентрифужную образцы в течение минимум 20 минут при 13000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С для осаждения ДНК / гликогена гранул.
- Промыть ДНК / гранулы гликогена с 1 мл 70% этанола.
- Воздух сухой гранулы или быстро сохнут в ДНК Savant центрифуги вакуум скорости.
Совет - не более сухой ДНК. - Ресуспендируют ДНК / гликогена гранул в 200 мкл буфера ТЕ.
- ДНК (1 мкл) готов к количественному помощью ПЦР в реальном времени. Магазин оставшиеся ДНК при 20 ° C.
Совет - Использование более 1 мкл ДНК может ингибировать ПЦР в реальном времени реакции, поэтому масштабы с осторожностью.
Часть 5: репрезентативные результаты:
Образцы чипа и входного ДНК количественно ПЦР в реальном времени 7,8 (Applied Biosystems 7500 Быстрый ПЦР в реальном времени система) с использованием праймеров, специфичных для локуса гена интересов. Грунтовки, что цель геномной последовательности, как известно, обогащенные или не хватает в модификации гистонов быть проанализированы может быть использован как положительный и отрицательный контроль, а также. Данные представлены в процентах от входа. ChIP процедура должна быть полностью тepeated с тремя биологическими репликацию для обеспечения об изменениях в модификации гистонов являются статистически значимыми.
Есть несколько важных вопросов, которые следует учитывать при использовании ПЦР в реальном времени количественно ДНК, в том числе праймеров, ПЦР эффективности и соответствующим образом для расчета процентов входной и нормализацию процедуры. При профилировании гистонов размещение модификации по гену, эффективность ПЦР должны быть согласованы между всеми пар праймеров. ПЦР в реальном времени системы производитель может предоставить необходимую информацию и обучение.
На рисунке 1 показан представителю результаты иммунопреципитации хроматина во время STAT1 активация гена IRF1 9, вызванных IFN-γ.
Рисунок 1. Заполняемость STAT1, РНК-полимеразы II и H3K36me3 динамична во STAT1 активация IRF1 гена. (A, B, C) чип с α-H3K36me3, α-STAT1 и α-Pol II хроматина собраны из 2FTGH клетки с индуцированной ИФН-γ в течение 30 минут (красные квадраты), 1,5 часов (синие кружки), 5 часов ( зеленые треугольники) или uninduced (черные алмазы). IgG является отрицательного контроля (серые кресты). (D) Пан H3 является положительным контролем и показывает гистонов размещение через локус в индуцированной (синие кружки) и uninduced условиях (черные алмазы). Падение около -5 б.п. происходит из-за истощения нуклеосом, что находится в местах старта транскрипции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ChIP протоколе изложены успешно используется в лаборатории для анализа более чем двадцати различных модификаций гистонов. Кроме того, мы охарактеризовали изменения в размещении транскрипционных факторов, гистон-модифицирующие ферменты, белки, которые признают модификации гистонов и РНК-полимеразы II транскрипции машин, в нескольких IFN-γ индуцированных генов. Мы также использовали процедуру, чтобы охарактеризовать изменения в модификации гистонов при дифференциации стволовых раковых клеток 10.
Качество ChIP данных в конечном счете зависит от эффективности антител используется и существует значительная вариабельность антител. Неспособность ChIP модификации, следовательно, не может быть истолковано как означающее, что указанное изменение не присутствует. Кроме того, изменения в той или иной модификации наблюдается в ChIP эксперимент может просто отражать изменение признание эпитопа на антитела, вызванные дополнительные модификации гистонов в соседнем остатков. Таким образом, ChIP результаты должны быть проверены и подходы, которые будут связаны наблюдаемые изменения в модификации гистонов биологических результат. Когда это будет сделано, чип представляет собой мощное средство для изучения хроматина основе механизмов, которые способствуют регуляции экспрессии генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа проводится при поддержке Университета Вирджинии, Университета штата Вирджиния онкологический центр и Томас Ф. и Кейт Миллер Джеффресс Мемориал Trust. Мы благодарим Джеймс Э. Дарнелл Lab (Rockefeller University) Роберт Росс Lab (Fordham University) для клеточных линий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Ethanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
References
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
- Hu, X., Ivashkiv, L. B. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. 31, 539-550 (2009).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).
- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).
- Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. Activities of IRF-1. J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).
- Ross, R. A., Spengler, B. A. Human neuroblastoma stem cells. Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).
