Summary
Ce protocole décrit comment la chromatine immunoprécipitation (ChIP) est utilisée pour étudier les altérations dynamiques du modèle de la chromatine qui régulent la transcription induite par une voie de transduction du signal.
Abstract
En réponse à une variété de ligands extracellulaires, la STAT (transducteur de signal et activateur de la transcription) des facteurs de transcription sont rapidement recrutés dans leur état latent dans le cytoplasme aux récepteurs de surface cellulaire où ils sont activés par la phosphorylation d'un seul résidu tyrosine 1. Ils ont ensuite dimériser et translocation vers le noyau de conduire la transcription de gènes cibles, affectant la croissance, la différenciation, l'homéostasie et la réponse immunitaire. Il n'est pas surprenant, étant donné leur implication dans les processus généralisé de cellules normales, dérèglement de la fonction STAT contribue à la maladie humaine, en particulier pour les cancers et les maladies auto-immunes 2 3.
Il est bien établi que la transcription est régulée par des modifications au modèle de la chromatine 4,5. Ces modifications comprennent les activités de l'ATP-dépendant de complexes, ainsi que covalentes modifications des histones et la méthylation de l'ADN 6. Parce que l'activation de l'expression génique STAT est à la fois rapide et transitoire, elle nécessite des mécanismes spécifiques permettant de moduler le modèle chromatine au locus du gène STAT-dépendante. Pour définir ces mécanismes, nous caractérisons les modifications des histones et les activités enzymatiques qui les génèrent à des loci génétiques qui répondent à STAT. Ce protocole décrit immunoprécipitation de la chromatine, une méthode qui est précieux pour l'étude de la STAT à la chromatine dans l'expression des gènes activés.
Protocol
PLANIFICATION
La veille d'une expérience de ChIP est prévu, les cellules doivent être cultivées de sorte qu'un nombre suffisant est disponible. Supposons que chaque dosage, il faudra ChIP ~ 1 à 1,5 x 10 7 cellules. Prévoyez toujours de faire les deux contrôles négatifs (IgG) et positifs (anticorps pan histones) et des expériences en double.
Astuce - Pour les cellules 2FTGH, chaque dosage puce nécessite environ une boîte de culture 15 cm de tissu à 80% de confluence.
PARTIE 1: PRÉPARER ET EFFECTUER CHROMATINE ChIP
- Retirez les milieux de culture et d'induire les cellules pour le temps nécessaire avec 20 ml de 10% de sérum de veau cosmique (CSC) / DMEM contenant de l'IFN-gamma à 5 ng / mL. Remplacez le support sur les plaques non induite avec 20 ml de 10% CCS / DMEM ainsi.
- Dans une hotte, ajouter 540 uL de formaldéhyde 37% à 20 mL de médias (1% en concentration finale) dans le plat de 15 cm.
Astuce - plaque inclinable et ajouter le formaldéhyde à la piscine des médias -, puis la plaque de roche pour l'étendre uniformément. - Permettre la réticulation se dérouler pendant 10 minutes à température ambiante.
- Ajouter à la glycine 0,125 M concentration finale de cesser de réticulation.
- Vide aspirer les médias et laver les cellules une fois avec 10 ml de phosphate de glace froide saline tamponnée (PBS).
- Recueillir les cellules avec un racleur de cellules dans ~ PBS 7 ml et combiner des cellules (à partir de 6 plaques) qui ont été traités de manière identique dans 50 ml tube conique sur la glace.
- Centrifugeuse (Beckman Coutler Allegra 12-R Centrifugeuse) à 1800 rpm à 4 ° C pendant 5 minutes et aspirer le PBS.
Astuce - Snap geler la cellule si arrêtant ici et conserver à -80 ° C à granulés - Reprendre le culot cellulaire dans 4 ml de tampon Gonflement (25 mM HEPES pH 7,8, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,1% NP40. Ajouter 1 mM de DTT, les inhibiteurs de protéase complète et refroidir sur glace avant utilisation) et le transfert à un 15 ml tube conique.
Astuce - Ce volume tampon gonflement est approprié pour une mise en commun 6 plaques (~ 6-9 x 10 7 cellules). Tampon plus ou moins pourrait changer l'efficacité douncing. - Incuber la suspension cellulaire sur la glace pendant 10 minutes.
- Transfert de suspension pour une pré-réfrigérée douncer 15 ml (Wheaton) et Dounce 20 coups avec son pilon A.
- Transfert dounced cellules vers un tube 15 ml conique sur la glace.
- Centrifuger à 2500 rpm pendant 5 minutes à 4 ° C et jeter le surnageant.
- Reprendre le nucléaire culot (~ 200 uL de 6 plaques) dans 3 ml (15 volumes granulés) de tampon de sonication (50 mM HEPES pH 7,9, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, 1% Triton X-100, le désoxycholate de sodium à 0,1%, 0,1% SDS. Ajouter les inhibiteurs de protéase complète et refroidir sur glace juste avant l'utilisation).
Astuce - Ce volume tampon de sonication est approprié pour une mise en commun 6 plaques (~ 6-9 x 10 7 cellules). Tampon plus ou moins pourrait changer l'efficacité sonication. - Soniquer suspension de noyaux sur la glace pendant 10 cycles (20 secondes on/40 secondes off / réglage de l'amplitude 8) en utilisant un sonicateur Misonix 3000 équipé de la micropointe. Ce se traduit généralement par des fragments de chromatine en moyenne 200-1000 pb en taille.
Astuce - Parce sonicateurs varient, l'efficacité sonication doit être déterminée empiriquement. Pour ce faire, de prendre des aliquotes de 20 uL avant sonication et après chaque cycle de sonication. La chaleur de ces échantillons à 65 ° C pendant 4 heures. Ajouter tampon de chargement de l'ADN et exécuter un standard de 1% d'agarose / TBE gel de visualiser les fragments d'ADN.) - Transfert soniqué matériel à un tube à centrifuger et centrifuger SS34 pendant 20 minutes à 4 ° C à 13000 rpm dans un rotor SS34 (Sorvall Centrifugeuse RC6 plus) pour obtenir un culot ce qui est habituellement une petite quantité de débris cellulaires.
- Soigneusement transférer le surnageant dans un tube de 15 ml conique sur la glace.
- Pré-clairement en ajoutant 360 uL de sperme de saumon ADN / protéine A ou G agarose perles lisier et bascule à 4 ° C pendant au moins 30 minutes.
Astuce - Cette étape réduit le bruit dans le test qui résulterait de la non-événements spécifiques contraignantes. - Centrifuger à 1000 rpm à 4 ° C pendant 5 minutes pour sédimenter les billes d'agarose.
- Transfert prédédouanés surnageant dans un autre tube de 15 ml conique sur la glace.
- Mesurer la A260 unités de la chromatine prédédouanés et ajuster le volume avec le tampon de sonication à quatre (4) unités A260 (0,2 mg / ml en supposant une unité = 0.050 A260 mg / ml)
Astuce - Pour mesurer l'A260 unités, diluer 10 uL d'prédédouanés chromatine dans 190 uL DDW; vierge spectrophotomètre avec 10 uL dans tampon de sonication DDW 190 uL. - Economisez 75 uL de la chromatine (à 4 unités A260) que l'échantillon d'entrée et de stocker à 20 ° C jusqu'au moment de renverser réticule.
Astuce - Cette étape est cruciale pour l'analyse des données. Ne négligez pas de prendre la partie aliquote d'entrée. - Aliquoter la chromatine préparées à 1,7 ml microtubes de sur iCE que aliquotes de 1 ml.
Astuce - Si l'arrêt ici, snap geler la chromatine préparées sur glace sèche et stocker à -80 ° C. NB: la chromatine stockées peuvent se dégrader, produisant moins de résultats optimaux, afin d'éviter si possible. - Ajouter les anticorps ChIP-grade aux échantillons induits et non induits jeux en double. Ajouter IgG (2 mg) et d'anticorps pan Histone H3 (15 uL) que les contrôles positifs et négatifs induits et non induits aux séries d'échantillons.
Astuce - La quantité d'anticorps à utiliser doit être déterminée de manière empirique ou voir la fiche produit du fournisseur pour des montants proposés. Typiquement 1-2 mg d'un anticorps ChIP-grade qui fonctionne bien. Le volume approprié doit être déterminée empiriquement pour des anticorps qui sont fournis que le sérum. - Tous les tubes rock la nuit à 4 ° C.
PARTIE 2: COLLECT immunocomplexes
- Ajouter 60 ul de sperme de saumon ADN / protéine A ou protéine G billes d'agarose coulis à tous les tubes.
Protéines Astuce Utilisez A pour les anticorps polyclonaux de lapin et de protéines G pour les anticorps monoclonaux de souris. - Rock à 4 ° C pendant au moins 60 minutes.
- Pellet les complexes immuns (billes d'agarose) par microfuging délicatement à 2000 rpm à 4 ° C pendant 3 minutes.
- Aspirer le surnageant.
- Laver les immunocomplexes avec 1 ml de chacun des tampons de lavage suivants pendant 10 minutes avec bascule à 4 ° C. Microfuge pendant 3 minutes à 2000 rpm à 4 ° C entre chaque lavage et aspirer le surnageant. Conserver les échantillons refroidis sur la glace. Ajouter PMSF juste avant l'utilisation.
- Lavez faible teneur en sel - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM de Tris-Cl, pH 8,0, NaCl 150 mM, PMSF 1 mM
- Laver en sel élevée - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM de Tris-Cl, pH 8,0, NaCl 500 mM, PMSF 1 mM
- LiCl Laver - 0,25 M LiCl, 1% NP-40, le désoxycholate de sodium à 1%, EDTA 1 mM, 10 mM de Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM de PMSF
- Lavez TE - deux lavages avec du tampon TE -10 mM de Tris-Cl, pH 8,0, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM
- Retirez le tampon de lavage finale TE et aux billes, ajouter 500 uL de tampon d'élution (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, EDTA 10 mM, SDS 1%).
Astuce - Le tampon d'élution doit être préparée fraîchement. - Vortex à mélanger des billes d'agarose dans un tampon d'élution et de la chaleur pendant 30 minutes à 65 ° C.
Astuce - Vortex chaque tube au moins toutes les 10 minutes au cours de cette 30 minutes. - Microfuge pendant 30 secondes à 2000 tpm et le transfert de l'éluant à un tube de centrifugeuse de nouvelles.
Astuce - Lors de l'élution, décongeler vos échantillons d'entrée et ajouter 500 uL de tampon d'élution à chacun. Inclure ces échantillons à toutes les étapes à venir. - Ajouter 5 M de NaCl à une concentration finale de 200 mM à tous les échantillons et les vortex.
- Incuber à 65 ° C pendant une nuit (ou au moins 4 heures).
PARTIE 3: ChIP'd purifier et l'ADN ENTRÉE
- Microfuge tous les échantillons pendant 30 secondes pour recueillir la condensation sur les paupières.
- Ajouter 1 microlitre de RNAse A (10 U / uL) à chaque tube et incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
- Ajouter 10 uL d'EDTA 0,5 M, 40 uL 0,5 M de Tris-Cl pH 6,5, 2 pl protéinase K (10 mg / ml) et incuber à 45 ° C pendant 60 minutes. Astuce Préparer un master mix de ces réactifs et ajouter 52 uL dans chaque tube.
- Extrait d'alcool phénol / chloroforme / alcool isoamylique puis chloroforme / alcool isoamylique extraire les échantillons.
- Ajouter 2 glycogène uL (25 ug / uL) et 0,1 volumes de pH 3M acétate de Na 5,2 et vortex.
- Ajouter 2,5 volumes d'éthanol 100% et le vortex.
- Incuber à 20 ° C la nuit.
PARTIE 4: ChIP'd purifier et l'ADN apport continu
- Échantillons Microfuge pour un minimum de 20 minutes à 13000 rpm à 4 ° C pour précipiter l'ADN / glycogène pellets.
- Laver avec de l'ADN / glycogène boulettes avec 1 ml d'éthanol à 70%.
- Air sec les granulés secs ou rapidement dans l'ADN Savant centrifugeuse sous vide vitesse.
Astuce - Ne pas trop sécher les ADN. - Resuspendre l'ADN / glycogène granulés dans 200 ul de tampon TE.
- L'ADN (1 pi) est prêt pour la quantification par PCR en temps réel. L'ADN magasin reste à 20 ° C.
Astuce - Utiliser plus de 1 pl d'ADN peuvent inhiber les réactions PCR en temps réel, afin d'échelle avec prudence.
Partie 5: résultats représentatifs:
Les échantillons d'ADN et de ChIP entrée sont quantifiées avec Real-Time PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System) utilisant des amorces spécifiques pour le locus du gène d'intérêt. Amorces qui séquence génomique cible connue pour être enrichi ou manquant de la modification des histones être testés peuvent être utilisés comme contrôles positifs et négatifs ainsi. Les données sont présentées comme pourcentage de l'entrée. La procédure de puce devrait être entièrement repeated avec trois biologiques réplique à s'assurer que les changements signalés dans les modifications des histones sont statistiquement significatives.
Il ya plusieurs questions importantes à considérer lors de l'utilisation PCR en temps réel pour quantifier l'ADN, y compris la conception d'apprêt, efficacité de la PCR, et la manière appropriée pour calculer les pour cent des procédures d'entrée et de normalisation. Lorsque profilage Occupation modification des histones sur un gène, l'efficacité de PCR doit être cohérente entre tous les couples d'amorces. Le fabricant en temps réel du système de PCR peuvent fournir les informations nécessaires et la formation.
La figure 1 montre des résultats représentatifs de la chromatine au cours immunoprécipité STAT1 activation du gène IRF1 9, déclenchée par l'IFN-γ.
Figure 1. Occupation de STAT1, l'ARN polymérase II et H3K36me3 est dynamique lors de STAT1 activation du gène IRF1. (A, B, C) à copeaux avec α-H3K36me3, α-α-STAT1 et Pol II de la chromatine recueillies à partir des cellules 2FTGH induite par l'IFN-γ pour 30 minutes (carrés rouges), de 1,5 heures (cercles bleus), 5 heures ( triangles verts) ou non induits (losanges noirs). IgG est le contrôle négatif (gris croix). (D) Pan H3 est le contrôle positif et montre l'occupation des histones dans le locus dans l'induit (cercles bleus) et les conditions non induits (losanges noirs). La baisse de -5 pb est dû à l'épuisement des nucléosomes qui se trouve sur les sites de démarrage de la transcription.
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Discussion
Le protocole décrit ChIP a été utilisé avec succès dans le laboratoire d'essai de plus de vingt différentes modifications des histones. En outre, nous avons caractérisé les changements dans l'occupation des facteurs de transcription, enzymes de modification des histones, protéines qui reconnaissent modifications des histones et la transcription de l'ARN polymérase II machines, à l'IFN-γ de plusieurs gènes induits. Nous avons également utilisé la procédure de caractériser les changements dans les modifications des histones au cours de la différenciation d'une cellule souche du cancer 10.
La qualité des données de la puce dépend finalement de l'efficacité de l'anticorps utilisé et il ya une variabilité considérable parmi les anticorps. L'échec d'une puce de modification, par conséquent, ne peut pas être interprété comme signifiant que ladite modification n'est pas présent. Par ailleurs, des changements dans une modification particulière observée dans une expérience puce peut simplement refléter un changement dans la reconnaissance de l'épitope par l'anticorps provoqués par d'autres modifications des histones au niveau des résidus à proximité. Par conséquent, les résultats puce doit être validée avec les approches qui ont trait aux changements observés dans une modification des histones à un résultat biologique. Lorsque cela est fait, CHIP est un moyen puissant pour étudier la chromatine des mécanismes qui contribuent à la régulation de l'expression génique.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par l'Université de Virginie, l'Université de Virginie Cancer Center et The F. Thomas et Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Nous remercions le James E. Darnell Lab (Rockefeller University), le Laboratoire de Robert Ross (Université Fordham) pour les lignées cellulaires.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Ethanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
References
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