وتشارك أكثر بسبب المشيماء الثابت والأجنة لينة ، والتلاعب في الأجنة في الميداكا من الزرد. هذا الفيديو يظهر خطوة بخطوة إجراءات لكيفية التعامل مع الأجنة الميداكا ، بما في ذلك dechorionation ، agarose المتصاعد في التصوير وزرع الخلايا لانتاج الوهم. هذه الإجراءات ضرورية لاستخدام الميداكا والزرد في مختبر للاستفادة الكاملة من ميزات التكامل بينهما للتشريح وظائف الجينوم الوراثي للالفقاريات.
الميداكا صغيرة أسماك المياه العذبة وضع البيض على حد سواء التي تتيح التحليلات الجينية والجنينية ، وهي واحدة من الكائنات الثلاثة النموذج في الفقاريات والتي نفذت على نطاق الجينوم النمط الظاهري يحركها شاشات متحولة إلى 1. اختلاف في تداخل الجينات الوظيفية ذات الصلة بين الميداكا الزرد ويسمح تحديد الظواهر الجديدة التي يتم التحقق من هويته في نوع واحد 2 ، وبالتالي الميداكا الزرد ومكملة للتشريح الجيني للجينوم الفقريات وظائف. التلاعب الميداكا الأجنة ، مثل dechorionation والأجنة المتصاعدة للتصوير وزرع الخلايا ، والإجراءات الأساسية للعمل على حد سواء الميداكا والزرد في المختبر. زرع الخلايا يفحص الحكم الذاتي خلية من الطفرات الميداكا. يتم إنشاؤها بواسطة زرع خلايا الوهم المسمى من أجنة المانحة في الأجنة المتلقي غير المسماة. يمكن زرع الخلايا المانحة إلى مناطق محددة من أجنة المستفيدة على أساس خرائط مصير 3 بحيث يمكن أن تكون متكاملة من استنساخ الخلايا التي تم زرعها في الأنسجة من خلال الاهتمام بالتنمية. وتشارك أكثر بسبب المشيماء الثابت والأجنة لينة ، والتلاعب في الأجنة في الميداكا من الزرد. في هذا الفيديو ، وتبين لنا إجراءات تفصيلية لمعالجة الأجنة الميداكا.
نحن في هذا الفيديو لشرح كيفية dechorionate وتنفيذ transplanataion الخلية على الأجنة الميداكا. هذا هو أسلوب قوية لإنتاج أجنة خيالية لدراسة الجينات / وظيفة البروتين خلال التنمية ، فضلا عن توضيح الحكم الذاتي من الجين / بروتين في السؤال. الميداكا تشكل نموذجا مفيدا الفقاريات النظام لهذا الأسلوب نظرا لخرائط مصير راسخة والقروض التي تقدمها لهم بشكل جيد للشفافية في مجال التصوير في الوقت الحقيقي الجسم الحي. ويمكن الجمع بين زرع مع microinjection (كما هو موضح في "Microinjection الأجنة الميداكا" البروتوكول المرافق له إن الرب) بحيث يمكن للسلوك الخلايا المزروعة ملاحظتها بسهولة.
The authors have nothing to disclose.
ويدعم هذا العمل عن طريق منحة مقدمة من لجنة نهر الميكونج لFS م.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Embryo medium | Reagent | Made in-house | N/A | 200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.) |
Micro-dissecting forceps | Tools | 55 INOX A.DUMONT&FILS | N/A | Very sharp fine tips for removal of chorion. |
Fine waterproof sandpaper – p2000 grit size | Tools | Hermes Abrasives Ltd. | N/A | Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions. |
3% methylcellulose | Reagent | Sigma | M 0512 | High viscosity for holding embryos in place during transplantation. |
1X BSS | Reagent | Made in-house | N/A | 20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use. |
Penicillin-streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 | Added to BSS when incubating dechorionated embryos. |
Pronase | Reagent | Calbiochem | 53702 | For dechorionation. |
Hatching enzyme | Reagent | Made in-house | N/A | For dechorionation. |
Tricaine mesilate (TMS) | Reagent | Sigma | A-5040 | 400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water. |
3% ultra-low gelling temp. agarose | Reagent | Sigma | A-2576 | Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation. |
Petri dish culture chamber | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 11-004-008 | Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation. |
Micromanipulator | Equipment | Narishige | N/A | Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation. |
Borosilicate glass capillaries | Tool | Harvard Apparatus | GC100-10T | For making transplantation needles. |
Flaming/Brown micropipette puller | Equipment | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | For making transplantation needles. |