Rescate de virus de gripe A a partir del ADN plásmido es una técnica experimental básica y esencial que permite a los investigadores de la gripe para generar virus recombinantes para estudiar múltiples aspectos de la biología de los virus de la influenza, y para ser utilizado como vectores potenciales o vacunas.
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Artículo de método
Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido
En este artículo
Resumen
Resumen
Los esfuerzos realizados por varios grupos de investigación de la gripe han sido fundamentales en el desarrollo y la mejora genética de la influenza A virus inversa. Originalmente establecida en 1999
Protocolo
1. Virus de la gripe de rescate de la transfección
Influenza A virus pertenece a la familia Orthomyxoviridae de cadena negativa virus ARN envuelto. La gripe A genoma del virus consiste en ocho diferentes genes de ARN de polaridad negativa que codifican, al menos, 11 proteínas virales (Figura 1) 4. Nos centraremos, en este informe, en el rescate de uno de la cepa de laboratorio más común, la gripe A/PR/8/34, 5 por medio de plásmidos ambisense (PDZ), que contiene los 8 segmentos de la gripe A/PR/8/34 viral ( Figura 2).
Para el rescate de los virus de la influenza recombinante de ADN ....
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Discusión
Rescate de los virus de la influenza recombinante de ADN plásmido es un proceso simple y sencillo una vez que el protocolo se realiza rutinariamente en el laboratorio, pero en un principio, varias cosas pueden salir mal. Es imprescindible tener una buena preparación de plásmidos para generar el virus. El mantenimiento adecuado de las líneas celulares (293T y MDCK) es crucial para el éxito de un rescate viral. Tradicionalmente, un marcador genético se inserta en un gen que codifica la gripe plásmido, mediante mutagénesis.......
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Divulgaciones
Mount Sinai School of Medicine tiene derechos de propiedad intelectual en el ámbito del virus de la influenza recombinante, y AG-S es un inventor de esta propiedad intelectual.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a los miembros pasados y presentes en la Adolfo García-Sastre y los laboratorios de Peter Palese para el desarrollo de la influenza técnicas de genética inversa y los plásmidos. La investigación en los laboratorios de AG-S está parcialmente financiado por CRIP, un centro financiado por el NIAID de Excelencia para la Investigación y Vigilancia de Influenza (HHSN266200700010C) y por las subvenciones NIAD R01AI046954, U01AI070469 y P01AI058113. La investigación en LM-S laboratorio está financiado parcialmente por el NIAID subvención RO1AI077719.
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Materiales
Las líneas celulares
293T (número de catálogo CRL-11268) y MDCK (número de catálogo CCL-34) líneas de células se mantienen en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 en DMEM 10% FBS, 1% de PS. Las células se forman a disposición de la American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 EE.UU.).
Huevos embrionados de pollo
Embrionados de 10 días de edad, los huevos de gallina se puede obtener de los Laboratorios Charles River, específico de abastecimiento patógeno aviar Fee (SPAFAS) Productos y Servicios aviar. Franklin Commons, 106 Ruta 32, North Franklin, CT 06254 EE.UU.. Los huevos se incuban a 37 ° C antes y después de la infección viral. Antes y después de la infección viral, los huevos son trasluz para determinar la viabilidad de los embriones. Es muy importante para buscar los huevos muertos, antes y después de la infección viral. Antes de la infección de un huevo muerto puede ser fácilmente identificables por la ausencia de vasos sanguíneos, así como la falta de movilidad del embrión. Al trasluz, los embriones vivos se mueven. Después de la infección viral de un huevo muerto (probablemente relacionada con la infección por virus de la gripe) se puede divisar por el mal aspecto de los huevos como se ve por el menor volumen y sangrienta de fluido alantoideo. Infectados con huevos son descartadas en doble bolsa de autoclave y autoclave siguiendo los procedimientos estándar.
Células de pollo de glóbulos rojos (RBC)
RBC de pollo se pueden comprar en las granjas Truslow, 201 Valley Road, Chestertown, MD 21620. Almacenar a 4 ° C. Para los ensayos de HA, lavado de 5 ml de RBC de pollo con 45 ml de PBS 1X en un tubo de centrífuga de 50 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 1000 rpm, RT. Descartar cuidadosamente el sobrenadante y el uso de una dilución 1:1000 de los pellets de glóbulos rojos en PBS 1X (concentración final de 0.5 a 1.0% de glóbulos rojos).
Sobrenadantes de cultivo de tejidos y fluidos alantoideo
Tanto, los sobrenadantes de cultivo de tejidos y fluidos alantoideo se puede almacenar a 4 ° C por un período corto de tiempo. Después de confirmar rescate de virus, los virus de sobrenadantes de las células o el líquido alantoideo se almacenan a -80 ° C.
Plásmidos
Todos los plásmidos se preparan con las recomendaciones de un kit de plásmido maxi fabricante siguiente. Todos los plásmidos son alícuota en concentraciones de 1 mg / ml en ddH2O y almacenadas a -20 ° C. Para almacenamiento a corto plazo, el plásmido se puede mantener a 4 ° C. La concentración del ADN plásmido purificado se determina por espectrofotometría a 260 nm, con la pureza que se calcula utilizando la relación de 260:280 nm. Preparaciones a 1,8-2,0 260:280 nm ratios se consideran apropiados para fines de salvamento virus. Además, la concentración de plásmido y la pureza debe ser confirmada con la cromatografía en gel de agarosa. Ambisense PDZ plásmidos (6) que contiene los ocho genes virales de la gripe A/PR/8/34 (7) se ilustra en la Figura 2.
Virus
El protocolo descrito para el rescate de la gripe A/PR/8/34 se puede realizar bajo nivel de bioseguridad (BSL) 2 condiciones. Material contaminado, incluyendo los sobrenadantes de cultivo de tejidos y los huevos embrionados, deben ser esterilizados antes de su eliminación. Rescate de otros virus de la influenza puede requerir mayores condiciones BSL y, por tanto, las condiciones especiales / medidas de seguridad tendrá que ser seguido.
Medios de cultivo y soluciones
DMEM 10% de SFB 1% PS: 445 ml de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), 50 ml de suero fetal bovino (FBS), y 5 ml de 100X penicilina / estreptomicina (PS). Almacenar a 4 ° C. Este medio se utiliza para mantener las células 293T y MDCK, así como para las transfecciones. DMEM 0,3% BA 1% PS: 495,7 ml de DMEM, 4,3 ml de 35% de albúmina bovina (BA). Almacenar a 4 ° C. Justo antes de su uso, agregar la tripsina TPCK tratada a una concentración final de 1 mg / ml. Los medios de comunicación infecciosas.
Fosfato de 10 veces (PBS): 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g de KH 2 PO 4. Añadir ddH2O hasta 1 litro. Ajustar el pH a 7.3. Esterilizar en autoclave. Conservar a temperatura ambiente.
1X PBS: Diluir 10 veces con PBS 1:10 ddH 2 O. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
Referencias
- Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).
- Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A.
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Reimpresiones y permisos
