Summary
L'objectif de cette étude était d'imiter le natif architecture à trois couches de la paroi artérielle. Pour ce faire, électrofilage a été employé avec l'utilisation d'un 3-1 (entrées-sorties) des buses et des mélanges de polycaprolactone, l'élastine et du collagène.
Abstract
Tout au long de l'artère native, le collagène et l'élastine joue un rôle important, fournissant une dorsale mécanique, empêchant rupture de la cuve, et de promouvoir la récupération sous des déformations pulsatile. L'objectif de cette étude était d'imiter la structure de l'artère native en fabriquant un conduit électrofilé multicouche composé de poly (caprolactone) (PCL) avec l'ajout d'élastine et de collagène avec des mélanges de 45-45-10, 55-35 - 10 et 65-25-10 PCL-ELAS-COL afin de démontrer les propriétés mécaniques du tissu artériel indicatives indigènes, tout en restant favorable à la régénération des tissus. Greffes et les différentes couches entières ont été analysées à l'aide d'essais de traction uniaxiale, la compliance dynamique, la rétention de suture, et résistance à l'éclatement. Les résultats de conformité a révélé que les changements de la couche moyenne / médiane globale a changé le comportement du greffon avec l'ensemble des valeurs le respect du greffon allant de 0,8 - 2,8% / 100 mmHg, alors que les résultats ont démontré une large uniaxiale module moyenne de 2,0 à 11,8 MPa. Tant les données et la conformité module affiché des valeurs dans la plage de l'artère native. La modélisation mathématique a été mis en œuvre pour montrer comment les changements dans la rigidité couche d'affecter la tension pariétale globale circonférentielle, et comme une aide à la conception pour réaliser la meilleure combinaison mécanique des matériaux. Globalement, les résultats indiquent que la greffe peut être conçu pour imiter une structure à trois couches en modifiant les propriétés de couche.
Protocol
- Avant électrofilage, le collagène, de corium bovins de 6 mois, doit être extraite en utilisant un processus basé acide acétique. Ce collagène extrait est ensuite purifié par une série subséquente de dissolutions, les précipitations et les dialyses. Une fois que le collagène est lyophilisée, le processus électrofilage peut commencer.
- Trois matières sont massées: polycaprolactone (PCL), l'élastine (ELAS) et le collagène (COL). Ces matériaux seront dissous séparément dans 1,1,1,3,3,3 hexafluoro-2-propanol (HFP, TCI America) à des concentrations de 100 mg / ml, 200 mg / ml, et 70 mg / ml, respectivement.
- Les matériaux sont mélangés dans cinq fioles à scintillation différents rapports volumétriques de 98-2-0 PCL-ELAS-COL (intima), 45-45-10, 55-35-10, 65-25-10 et PCL-ELAS-COL (médias), et 70-0-30 PCL-ELAS-COL (adventice).
- Pour les essais de traction uniaxiale et individuels des tests de conformité couche, chacun des matériaux a été individuellement électrofilé, tout multi-couches pour les greffons vasculaires éclaté, la rétention de suture, et les tests de conformité ont été électrofilé d'une configuration de 3 à 1. Uniaxiale échafaudages essais de traction ont été plate et rectangulaire (2,5 cm de large x 10,2 cm de long x 0,3 cm d'épaisseur) depuis le 2 mandrins mm de diamètre utilisé pour electrospin couches individuelles et multi-couches greffes étaient trop petits pour le poinçonnage des échantillons d'essai.
- Pour les deux électrofilage individuels et multi-couches, les solutions de polymères ont été chargés dans une seringue de plastique 3 ml Becton Dickinson avec un 18-Gage émoussée pointe de l'aiguille, et placée sur un pousse-seringue à un taux fixé officine. Les taux de électrofilage été fixé à 4 ml / h, tandis que les taux électrofilage multi-couches ont été variés en fonction de transition et de la couche. Les débits et les volumes ont été en tant que tels: l'intima était électrofilé à un taux de 4 ml / h et un volume de 0,5 ml suivie d'une transition combinant les deux seringues intimale et médiale de 0,2 ml à 2 ml / h chacune. La seringue a été intimale, puis coupez et la couche médiane a été autorisé à tourner pour 0,6 ml à 4 ml / h suivie d'une transition entre le média et l'adventice pour 0,2 ml de solution de polymère à 2 ml / h chacune. Enfin, les médias ont été arrêtés et l'adventice a été autorisé à tourner pendant 0,4 ml à 4 ml / hr.
- Tous les échantillons ont été réticulés dans 50 mM d'EDC pendant 18 heures avant tout essai 1.
- Essais de traction uniaxiale a été réalisée sur six échantillons d'une feuille électrofilé hydraté dans du PBS pendant 24 heures. "Os de chien" en forme d'échantillons ont été perforées par des nattes électrofilé et testé sur un système MTS Bionix 200 tests avec une cellule de charge de 100 N et un taux d'extension de 10,0 mm / min. Pic de contrainte, le module, et la déformation à la rupture ont été calculés en utilisant la version TestWorks 4.
- Test de rétention de suture a été réalisée sur six échantillons de 2 mm de diamètre intérieur tubulaire de six greffes électrofilé différents, trempés dans du PBS pendant 24 heures à 37 ° C, sur un système MTS Bionix 200 tests avec une cellule de charge de 50 N (MTS Systems Corp) et un taux d'extension de 150,0 mm / min en conformité avec la ligne droite à travers la procédure décrite dans l'American National Standards Institute 2. 5-0 commerciales PDS II suture de monofilament violette était placée à 2 mm de la fin de l'échantillon et prolongée jusqu'à la suture avait tiré à travers la greffe. Charge de pointe a été enregistrée en grammes-force en utilisant la version TestWorks 4.
- Test résistance à l'éclatement a été réalisée sur six échantillons provenant de six greffes électrofilé différents. Tubes en rafale, 2-3 cm de longueur, ont été hydratés dans du PBS, équipés de plus de 1,5 mm de diamètre mamelons relié à l'appareil, et sécurisé avec 2-0 suture de soie. Air a été introduit dans le système, en augmentant la pression à un taux de 5 mmHg / s jusqu'à ce que le tube éclaté 2. Les résultats sont exprimés en mmHg de la pression à laquelle les tubes rompus.
- Compliance dynamique a été déterminé pour six de 2 mm de diamètre intérieur greffes tubulaires prises à partir de six greffes électrofilé différents à une longueur de 3 cm sous conditions physiologiques simulées. Les deux couches individuelles et à plusieurs niveaux des constructions tubulaires ont été électrofilé et testé dans les mêmes conditions. Les échantillons ont été testés dans un génie tissulaire intelligente via la stimulation (items) bioréacteur mécanique développée par Tissue Growth Technologies remplis avec du PBS à 37 ° C. Le bioréacteur à condition d'un changement cyclique de la pression 1Hz à l'intérieur de la greffe, où trois différents niveaux de pression du 90/50, 120/80 et 150/110 mm Hg systolique / diastolique ont été étudiés 2, 3.
Les résultats représentatifs
Lorsque les protocoles électrofilage sont effectuées correctement, le produit final devrait être un doux, de tubes sans soudure, sans signes initiaux de délaminage entre les couches. Lorsque les essais de traction uniaxiale, les tests de résistance à l'éclatement, des tests de rétention de suture, et des tests de conformité sont effectuées, les résultats doivent indiquer que la rigidité couche médiane est augmentée, avec des quantités diminuées de l'élastine, les propriétés mécaniques associées doivent démontrer une plus rigide du tube.
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Discussion
La partie la plus critique de cette étude est le processus électrofilage. Lorsque vous utilisez un 3-1 d'entrée-sortie de buse, arquées et la perte de charge peut se produire. Si cela se produit, la tension associée avec le polymère qui tourne va diminuer entraînant soudés, «humide» et la création d'une délamination des fibres entre chacune des trois couches. Par conséquent, conformément potentiels électriques sont indispensables pour obtenir un idéal du tube multi-couches.
Décalage de conformité est l'une des causes principales d'occlusion du greffon au niveau de petit diamètre. Développer une greffe multi-couches vasculaires offre la possibilité d'adapter les propriétés du greffon vers quelque chose qui pourrait imiter la biomécanique naturelle et l'architecture de l'artère native. Comme les étapes du traitement d'un progrès à plusieurs niveaux greffon vasculaire à l'avenir, notre laboratoire va enquêter sur les éventuelles limitations telles que la délamination des couches tout l'échafaudage subit une dégradation en plus la taille des pores adéquat pour une infiltration cellulaire. Pour tester cela, deux acellulaire et cellulaire dans les études de dégradation in vitro sera réalisée sous culture statique et dynamique. Ces tests détermineront la fois les capacités migratoires des échafaudages et comment ils vont dégrader efficacement dans des conditions physiologiques.
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Disclosures
Plusieurs auteurs ont Etats-Unis et brevets internationaux en cours concernant la technologie présentée dans ce manuscrit, et cette technologie a été autorisé à Organogenesis, Inc
Acknowledgments
Nous tenons à remercier l'American Heart Association Mid-Atlantic affiliation (0555407U, GLB) pour le financement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polycaprolactone | Sigma-Aldrich | ||
| Elastin | Elastin Products Company | ||
| Collagen | |||
| Acetic Acid | Fisher Scientific | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | ||
| TRIS | Fisher Scientific | ||
| 6 L Avanti J-HC Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| 1,1,1,3,3,3 hexafluoro-2-propanol | TCI America | ||
| 3 ml Becton Dickinson Syringe | |||
| CZE1000R Rack Mount Power Supply | Spellman | ||
| High-Pressure Syringe Pump | Cole-Parmer | ||
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide | Pierce, Thermo Scientific | ||
| 70 % ethanol | Sigma-Aldrich | ||
| ImageTool 3.0 software | Shareware provided by UTHSCSA | ||
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| MTS Bionix 200 testing system | MTS Systems Corp. | ||
| TestWorks version 4 | |||
| Intelligent Tissue Engineering via Mechanical Stimulation (ITEMS) Bioreactor | Tissue Growth Technologies |
References
- McClure, M. J., Sell, S. A., Barnes, C. P., Bowen, W. C., Bowlin, G. L. Cross-linking Electrospun Polydioxanone-Soluble Elastin Blends: Material Characterization. Journal of Engineered Fibers and Fabrics. 3, 1-10 (2008).
- Cardiovascular implants - Vascular graft protheses. VP20, AAMI Press. Bethesda, MD. (1994).
- McClure, M. J., Sell, S. A., Simpson, D. G., Walpoth, B. H., Bowlin, G. L. A three-layered electrospun matrix to mimic native arterial architecture using polycaprolactone, elastin, and collagen: A preliminary study. Acta Biomater. , (2010).
