Summary
레이저 박리 전기 분무 이온화 (LAESI)는 질량 분광법에 대한 대기 압력 이온 소스입니다. 이미징 모드에서 중간 적외선 레이저 프로브 조직 섹션 또는 biofilm에 걸쳐 분자의 배포판. 이 기술은 원래 실험 조건 하에서 수행 다양한 bioanalytical 연구에 대한 새로운 접근법을 제공합니다.
Abstract
질량 분광법에서 대기 이온화 방법은 분석 조사가 모국어와 같은 실험 조건에서 조직이나 biofilm에서 직접 수행할 수있게합니다. 레이저 박리 전기 분무 이온화 (LAESI)는 하나의 개발이며, 특히 물이 포함된 표본 조사에 적합합니다. LAESI은 샘플의 물 분자를 자극 중간 적외선 레이저 빔 (2.94 μm의 파장)를 사용합니다. 절제 fluence 임계값이 초과되면, 샘플 자료 미립자 물질의 형태로 퇴학이 projectiles은 샘플 표면 위에서 mm 수만 여행입니다. LAESI,이 절제 플륨는 배출 샘플 자료의 일부를 캡처 및 가스 상 이온에의 화학적 성분을 변환하는 높은 비용이 청구 방울에 의해 포착됩니다. 대기 압력 이온 소스 인터페이스를 갖춘 질량 분석기는 시료의 탐지 영역 (픽셀)에서 발생하는 발표 이온의 구성을 분석하고 기록하는 고용됩니다. 픽셀의 배열을 통해 체계적인 심문은 microprobe 분석 모드에서 분자 이미징을위한 방법을 엽니다. LAESI 질량 spectrometric 이미징의 독특한 측면은 측면 이미지와 함께, 3 차원 (3D) 분자 이미징을 가능하게, 깊이 프로 파일링입니다. ~ 100 μm의 각각 ~ 40 μm의, 현재 수평 깊이 해상도로 LAESI 질량 spectrometric 영상은 생물 학적 조직의 분자 구조를 탐구하는 데 도움이됩니다. 여기에, 우리는 LAESI 시스템의 주요 요소를 검토하고 성공적인 영상 실험에 대한 지침을 제공합니다.
Protocol
다음 프로토콜은 레이저 박리 전기 분무 이온화 (LAESI) 실험의 주요 단계를 설명하고 동물과 식물 조직 샘플에 대한 측면과 입체 (3D) 영상을위한 대표적인 예제를 제공합니다. 추가 실험 및 기술 정보는 다른 곳에서 얻을 수 있습니다. 1-6는
1. 조직 준비 및 마운트
- sectioning이 필요한 경우, 조직은 -20 -10에서 10-100 μm의 두께로 자른 섹션에 cryomicrotome를 사용 ° C 달리 특정 조직 유형에 대한 권장하지 않는 한.
- 직접 화학 수정자없이 평평한 표면 (예 : 화학적 사전 청소 유리 슬라이드)에 섹션을 탑재합니다. 분석하는 동안 항상 냉동 조직을 유지하기 위해 해동 장착시 sectioned 조직은 섹션을 해동 장착 즉시 펠티어 냉각 단계에 샘플 홀더를 확보. 이 단계는 섹션에서 분자 마이 그 레이션을 최소화 / 방지하기 위해 필요합니다.
- 필요한 경우, 조직은 냉동 유지하는 펠티어 단계에서 열 제거를 용이하게하기 위해 저전력 팬이 장착된 히트 싱크를 사용합니다.
- 시간 (1-2시간)의 연장 기간 동안 습기 환경에서, 물 또는 조직 표면에 얼음의 응축을위한 검사. 조직에 물이 응축은 detrimentally LAESI 실험에서 이미징 성능에 영향을 미치는 1.
- 필요한 경우, 룸 dehumidifier을 사용하거나 결로를 방지하기 위해 불활성 가스 (예 : 건조 질소 가스)로 가득 환경 챔버의 냉각 샘플 장소 1.
2. LAESI 이온 소스의 최적화
LAESI 이온 소스는 중간 적외선 레이저, 가벼운 스티어링을위한 광학 요소의 시리즈와 초점을뿐만 아니라 추가 샘플 홀더, 냉각 부품, 번역 단계 및 용매 전달 시스템으로 구성되어 있습니다. 그림 1은 질량 분석계의 대기 압력 이온 소스의 입구에 관련하여 이러한 요소의 전형적인 배치를 보여줍니다.
- 그림 1, 위치 질량 분석기 샘플링 콘 (D 또는 - FP)의 구멍 아래의 샘플 15-20mm에 그림과 같이.
- 2.94 μm의 파장과 10 Hz에서 반복 속도 중반 IR 레이저를 운영하고 있습니다. ~ 100 μJ / 펄스 에너지의 레이저 출력을 감쇠.
- 몇 가지 일반적인 입사에서 샘플에 레이저 펄스 에너지 (샘플 표면에 대하여 바로 입사 각도를 볼 수있는 레이저 파장 (예, 평철의 카페 2 ZnSe 렌즈)에서 투명 금색 거울과 초점 렌즈의 조합을 사용 그림 1).
- 질량 분석계 샘플링 콘의 구멍 앞 중간 적외선 빔 축 5~8밀리미터를 놓습니다.
- 초점 렌즈 위치와 초점 자리에 조직 제거를 달성하기 위해 레이저 빔을의 펄스 에너지를 조정합니다. ablated 볼륨의 크기는 이미징 응용 프로그램에 대한 픽셀 (또는 3 차원 영상의 voxel) 크기를 확인합니다.
- 질량 분석계의 입구 축과 일치하며 ~ 10 mm의 구멍 - 투 - 에미터 팁 거리 (그림 1 참조)에서 nanospray의 방사체를 놓습니다.
- 전기 분무의 경우, 각각 0.1 % 초산 또는 긍정적이거나 부정적인 이온 모드 0.1 % 암모늄 아세테이트 첨가제로 50 % 메탄올 솔루션을 준비합니다. 기타 유기 용제 이러한 acetonitrile, 이소프로판올, 등, 샘플에 따라 분석 작업에 대한 적절한 농도에서 메탄올을 대체할 수 있습니다. 전기 분무의 안정성을 성공적으로 영상을 위해 매우 중요합니다. 용매 선택에 따라 유량과 분사 전압 안정 스프레이를 달성하기 위해 조정해야합니다.
- 반응 LAESI 6 이미징 애플 리케이션에서, electrosprayed 솔루션 reactants를 포함할 수 있습니다.
- ~ 300 NL / 분 유량에 전기 분무 방출을 통해 전기 분무 솔루션을 제공하기 위해 주사기 펌프를 사용합니다.
- 질량 분석계의 구멍은 낮은 전압 (<500 V는 지상으로부터 측정)에 보관하는 경우, 전기 분무 방출기 (예, 3000 V)로 직접 고압을 적용하거나 금속 노조를 통해 전기 분무를 생성합니다. 그렇지 않으면, 전기 분무를 구축하기 위해 직접 전기 분무 방출기 또는 금속 노조를 통해 지상.
- LAESI에 의해 가장 효율적인 이온 생성을위한 모드를 분사 콘 제트의 전기 분무 소스를 운영하고 있습니다. 질량 스펙트럼에서 분사 모드 및 효과에 대한 운영 변수의 효과를 보려면 다른 토론을 참조하십시오. 5,7,8은
- 조심스럽게 같은 비행기에 레이저 빔을, 방출 및 오리피스 도끼를 유지하면서 LAESI 이온 수율을 최적화하기 위해 LAESI 설정의 상대적 거리를 조정합니다. 다른 자세한 지침을 찾아 주시기 바랍니다 5.
- 광학 현미경으로, 시료의 절제 분화구의 측면 크기를 결정합니다.
- 입체 LAESI 이미징 실험을 위해, 개별 펄스와 절제를 수행하고 예를 들어, 사용 voxel의 깊이를 결정 광학 현미경의 Z - 스택 모드 3.
3. 분자 이미징 및 데이터 분석
이미징 실험에서 조직 샘플보다 크거나 박리 영역의 크기와 동일한 단계 크기 X와 Y 방향으로 레이저의 초점 평면에서 이동합니다. 공간 해상도는 입사 레이저의 초점에 의해 제한됩니다.
- 샘플 표면에 대한 관심의 영역을 선택하고 (X, Y)가 해당 경계 좌표 구하십시오.
- 몇 군데로 구역이 지남에 따라 각 픽셀에 시간을 머물러 선택과 샘플 표면을 래스터로있는 gridding 알고리즘 (예, 적응 그리드, 선택된 지역 이미징, 직사각형 그리드, 나선형 패턴, Z 스캔 등) 선택할 수 있습니다.
- 3 축 번역 무대와 정해진 그리드에 따라 샘플을 rastering 수있는 소프트웨어를 사용합니다.
- 이미징에 필요한 총 시간을 계산합니다.
- 질량 분석계의 데이터 수집 시간 제한을 해제합니다. 이것이 불가 능할 경우, 계산 이미징 시간 값을 데이터 수집 시간 제한을 설정합니다.
- LAESI 측면 이미징 실험을 수행하기 위해 각 픽셀에 머물러있는 시간 내에 질량 스펙트럼에 충분한 신호 대 잡음 비율을 생산하기 위해 적절한 반복 속도 중간 적외선 레이저 소스를 시작합니다. 3D 분자 이미징을 위해 성공적으로 단일 레이저 펄스 내에서 생성된 이온을 대량 분석 레이저 소스 반복 속도보다 높은 스펙트럼 수집 속도를 사용합니다. 절제 시퀀스를 시작하려면 시작 신호를 기다립니다.
- 전기 분무 소스를 켭니다. 이미징에 필요한 전체 시간에 대한 충분한 해결책이 있는지 확인합니다.
- 동시에 대량 스펙트럼의 인수 중반 IR 레이저 박리 및 표면 검사를 시작합니다.
- 이미징 실행이 완료되면, 표면 검사, 중반 IR lasing 및 데이터 수집를 중지합니다.
- 레이저 소스를 해제합니다.
- 높은 전압의 전원을 끕니다.
- 주사기 펌프를 전환합니다.
- 대기 모드로 질량 분석기를 설정합니다.
- 펠티어 냉각 전자를 끄십시오.
- 사용하면 불활성 가스 흐름을 닫습니다.
- 해당 검사 결과와 3 차원 분석 측면 영상이나 voxels에있는 픽셀의 절대 좌표를 연관시키는 소프트웨어를 사용합니다.
- 수평 및 3D 분자 이미지를 얻기 위해 분석의 절대 좌표를 상대로 선택한 M / Z 값에 대한 이온 강도 신호를 플롯.
4. 대표 결과
그림 2는 몇 가지 주요 조직 유형 및 이미징 modalities에 대한 대표적인 결과를 제공합니다. 패널 탈수를 방지하기 위해 실험 기간 동안 냉동되어 동물의 조직 섹션에 대한 사건을 묘사. 또한 1, 샘플이 샘플 표면에 응축에서 주변 물 증기를 피하기 위해 건조 질소 가스 환경에 위치했다. 쥐 두뇌의 100 μm의 두께 코로나 섹션 (Rattus norvegicus)가 옆으로 LAESI와 몇 군데했다. 두뇌의 해부 지역 (패널에 광학 이미지를 볼 A) 분자 plasmalogens PC 용 얻은 이미지 (O - 33 : 3)와 좋은 상관 관계 표시 및 / 또는 PE (O - 36 : 3) M / Z 728.559과 함께합니다.
패널 B는 제브라 공장 (Aphelandra squarrosa) 잎 조직의 3D LAESI의 이미지를 보여줍니다. 단풍은 탈수에 대한 자연 방어 메커니즘을 가지고 있기 때문에 샘플은 주위 환경에서 심문 수 있습니다. 3 얻은 3D 분자 이미지 기본 및 보조 metabolites에 대한 유통 패턴의 다양한 밝혔다. 다른 사람들과 M / Z 285.076과 acacetin는 다른 균일한 분포로 위로부터 두 번째 및 세 번째 레이어의 노란 분야에서 높은 이온 카운트에서 검색되었습니다. 이 배포판은 광학 이미지에서 본 잡색의 패턴으로 동의했다.
그림 1. LAESI 시스템의 개략도 (ES, 전기 분무의 에미터 팁, 또는, 질량 분석계 샘플링 콘의 구멍, FL, 렌즈를 집중, FP, 초점, P, 펠티어 냉각 단계, HS, 히트 싱크). 분자 및 샘플 이온 (녹색 점들)와 씨앗 충전 방울을 낼 수있는 전기 분무와 중반 IR 절제 (빨간색 점) coalesces 동안 퇴학 미립자 문제의 부분. 이러한 방울에서 발표 이온 분석 및 질량 분석기에 의해 기록됩니다.
그림 2. 수평 및 3D imagi에 대한 대표적인 결과를. 또는 PE (O - 36 / : LAESI 질량 분석계와 함께 NG (A) 상단 패널은 쥐의 두뇌 (Rattus norvegicus) 코로나 섹션 plasmalogens PC 용 얻은 분자 이미지의 광학 이미지 (3 O - 33) 모습 : 3) M / Z 728.559. 흰색 규모 막대가 1mm에 해당합니다. 의 허가 (참고 1) 적응. 저작권 2010 미국 화학 학회. (B) 하단 패널은 잡색 제브라 공장 (Aphelandra squarrosa)에서 나뭇잎의 3D 이미지를 보여줍니다. M / Z 285.076과 Acacetin은 다른 사람의 균일한 분포로 위로부터 두 번째 및 세 번째 레이어의 노란 분야에서 높은 이온 카운트에서 검색되었습니다. 의 허가 (참고 3) Reprinted. 저작권 2009 미국 화학 학회.
Discussion
다른 조직 유형이 효과를 완화하기 위해 차례로, 샘플의 박리 특성에 영향을 미칠 수, 물, 컨텐츠 및 인장 강도. 9 다양한 전시, 그것은 사이에 변화하는 때 레이저 fluence, 샘플 처리 및 분석 프로토콜 개정 않는다 주요 조직 유형.
단일 셀 또는 고해상도 수사, 중간 적외선 대신 초점 렌즈의 둘레에 광섬유로 결합 수 있습니다. 조직에서 선택한 세포의 근접 이내에 섬유 팁을 위치하여 10, LAESI 분석을 수행할 수 단일 세포 수준.
주위 이온화 질량 분광법에 대한 레이블이없는 이온 소스로, 11 LAESI는 조직의 생화 학적 과정의 조사에 대한 잠재력을 보이지 않고있다. 직접 분석, 수평 및 3D 이미징의 추가 혜택과 함께, LAESI는 프로파일뿐만 아니라 이미징 어플 리케이션을위한 새로운 bioanalytical 도구입니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 에너지의 미국학과 (DEFG02 - 01ER15129)에 의해 부여 번호 0719232 아래에있는 미국 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해이 작품의 재정 지원에 감사하며, 프로 테아 Biosciences, 주식 회사 (모건, WV)에 의해. 저자는 또한 프로토콜 찍고하는 동안 그녀의 도움 제시카 A. Stolee 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mass spectrometer | Waters | Q-TOF Premier | |
| Mid-IR laser | Opotek Inc. (Carlsbad, CA) | Vibrant IR |
References
- Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. Simultaneous Imaging of Small Metabolites and Lipids in Rat Brain Tissues at Atmospheric-Pressure by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 82, 982-988 (2010).
- Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure, in vivo, and imaging mass spectrometry. Anal Chem. 79, 8098-8106 (2007).
- Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. Three-dimensional imaging of metabolites in tissues under ambient conditions by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 81, 6668-6675 (2009).
- Nemes, P., Barton, A. A., Li, Y., Vertes, A. Ambient molecular imaging and depth profiling of live tissue by infrared laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 80, 4575-4582 (2008).
- Nemes, P., Vertes, A. Laser ablation electrospray ionization for atmospheric-pressure molecular imaging mass spectrometry. Mass Spectrometry Imaging. Methods in Molecular Biology. Nemes, S. S., Rubakhin, J. V. , Springer. Volume 656 (2010).
- Shrestha, B. Direct analysis of lipids and small metabolites in mouse brain tissue by AP IR-MALDI and reactive LAESI mass spectrometry. Analyst. 135, 751-758 (2010).
- Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal Chem. 79, 3105-3116 (2007).
- Nemes, P., Goyal, S., Vertes, A. Conformational and noncovalent complexation changes in proteins during electrospray ionization. Anal Chem. 80, 387-395 (2008).
- Vertes, A. Molecular imaging by Mid-IR laser ablation mass spectrometry. Appl Phys A-Mater Sci Process. 93, 885-891 (2008).
- Shrestha, B., Vertes, A. In situ metabolic profiling of single cells by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 81, 8265-8271 (2009).
- Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Ambient mass spectrometry. Science. 311, 1566-1570 (2006).
