어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

요약

여기 electrophysiological 레코딩을위한 마우스 망막의 어두운 적응 조각을 생성하는 절차를 설명합니다.

초록

우리의 시각적 경험은 우리의 망막 photoreceptors의 시각 색소가 빛 에너지의 광자를 흡수하여 세포막의 순환 - 염기 - 문이 채널의 폐쇄로 이어질 세포 사건의 폭포를 시작하면 시작됩니다. 멤브레인 전위의 결과로 변경 막대와 원뿔 시냅스 터미널 모두에서 신경 전달 물질 방출의 양을 감소에 차례로 연결됩니다. photoreceptor 막 잠재력에 가벼운 evoked 변화가 망막에 하류 활동으로 연결 방법을 측정하기 위해 과학자들은 수십 년 ^1,2에 대한 망막 슬라이스 준비에서 electrophysiological 음반을 만들었습니다. 과거에는 이러한 조각은 거름종이에 첨부되어 망막 조직에 면도날로 수동으로 절단되었습니다;과 함께 최근 몇 년 동안 깔끔히의 또 다른 방법은 망막 조직이 낮은 겔화 온도 한천 배지에 포함된 의하여 개발되었으며 냉각 솔루션에 슬라이스 마이크로톰 ^{3,4 진동.} 이 준비가 덜 표면 손상이 매우 강력한 빛을 evoked 반응과 함께 망막 조각을 생산하고 있습니다. 여기 우리는이 절차는 시각 색소를 표백되지 않도록 적외선에 따라 할 수있는 방법을 문서.

프로토콜

1. 준비 전극

1. 1M NaCl의 모두를 수영하고 둘 사이 15V 운전 ~ 20 S.에 대한 1 Hz에서 사인 파를 사용하여 녹음과 참조 전극을 준비
2. micropipette 풀러 (서터 인스 트루먼 트의 P - 97을)를 사용하여 기록 전극을 만듭니다. 패치 - pipettes은 1.2 mm의 외부 직경 0.69 mm (셔터 인 스트 루먼트, 고양이 # B120 - 69 - 10)의 내경과 borosilicate 유리를 사용하십시오. 전극의 끝부분을 통해 일련의 저항을 측정합니다. MΩ ~ 12 세포 기관에 대한 MΩ ~ 5 ~ 직경 5 μm의 사용 세포 기관에 대한 ~ 직경 20 μm의 사용, 피펫 팁 직경을 선택 대상 세포의 크기에 따라.
3. 지상 / 참조 전극을 준비합니다. 1M NaCl에서, 주사기를 사용하면 (CAT # A7002 시그마) 3.5 % 아가르를 포함 1 ㎜ NaCl과 작은 섹션 폴리에틸렌 튜브 (Intramedic, PE205)를 입력합니다. 자세 / AgCl 기준 전극을 통해이 한천 다리를 놓습니다.

2. 준비 솔루션

1. 외부 목욕 솔루션, 에임스 '비카보네이트 (1 패)를 포함하는 미디어 : 에임 스의 1 병'중간 (시그마, 고양이 # ....

토론

척추 망막에서 슬라이스 녹음 수십 년 ^1,2에 대해되었습니다, 그리고 망막 회로는 입사 광을 인코딩하는 방법에 깊은 이해를 제공하는 매우 성공적으로되었습니다. 진동 마이크로톰와 절삭 오히려 직접보다 면도날로의 장점은 망막 조각이 표면에 덜 손상을 초래한다는 것입니다. 흡입 피펫으로 그것은 단지 세포 유형의 대부분 ^5,6을 확인했습니다 망막 회로, 그들의 연결을 유지 표면 아래 손상 및 대상 건강한 세포를 제거하는 간단하고, 표시되는 강력한 반응을 빛을 수 있습니다. 따라서 어두운 적응 망막 조각의 패치 클램프 녹음 신경 계산에서 확인 휴대 클래스에 의해 재생 역할을 결정하기 위해 조사를 허용할 수 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마이크로피펫 풀러	Sutter Instrument Co.	P-97
붕규산 유리	Sutter Instrument Co.	B120-69-10
폴리에틸렌 튜브	Intramedic	PE205
한천(Agar)	Sigma-Aldrich	A7002
저융점 아가로스	Sigma-Aldrich	A0701
Ames’ 배지	Sigma-Aldrich	A1420
페니실린-스트렙토마이신	Sigma-Aldrich	P0781