Gramicidine basée Assay fluorescence; pour déterminer le potentiel de petites molécules pour modifier les propriétés bicouche lipidique

Résumé

Nous introduisons une vitesse basées sur la fluorescence de dosage qui surveille le taux de la trempe de fluorescence comme une mesure de l'activité du canal gramicidine. Les canaux de gramicidine sont utilisés comme capteurs de force moléculaire pour surveiller les changements dans les propriétés de bicouche lipidique telle que détectée par des protéines bicouche couvrant.

Résumé

Beaucoup de médicaments et d'autres petites molécules utilisées pour moduler la fonction biologique sont des amphiphiles qui s'adsorbent à l'interface bicouche / solution et ainsi modifier les propriétés bicouche lipidique. Ceci est important car les protéines membranaires sont énergétiquement couplées à leur hôte en bicouche interactions hydrophobes. Les changements dans les propriétés bicouche ainsi modifier la fonction des protéines membranaires, qui offre un moyen indirect pour amphiphiles pour moduler la fonction des protéines et un mécanisme possible pour "hors cible" effets des médicaments. Nous avons déjà développé un essai électrophysiologique pour détecter des changements dans les propriétés de bicouche lipidique utilisant des canaux de gramicidine linéaires comme sondes ^3,12. Canaux gramicidine sont des mini-protéines formées par la dimérisation de deux transbilayer non-conductrice sous-unités. Ils sont sensibles aux changements dans leur environnement membranaire, ce qui les rend puissants sondes pour surveiller les changements dans les propriétés de bicouche lipidique telle que détectée par des protéines bicouche couvrant. Nous avons maintenant la preuve un dosage par fluorescence pour détecter des changements dans les propriétés bicouche en utilisant les mêmes canaux que les sondes. Le dosage est basé sur la mesure de l'évolution temporelle de la trempe de fluorescence de fluorophores chargés vésicules unilamellaires grande partie grâce à l'entrée d'un désactiveur à travers les canaux de gramicidine. Nous utilisons la fluorescence indicateur / désactiveur paire 8-aminonaphtalène-1 ,3,6-trisulfonate (ANTS) / Tl ⁺ qui a été utilisé avec succès dans d'autres dosages extinction de la fluorescence ^5,13. Tl ⁺ imprègne la bicouche lipidique lentement ⁸ mais traverse aisément la réalisation des canaux de gramicidine ^1,14. La méthode est évolutive et adaptée pour les deux études mécanistes et criblage à haut débit de petites molécules pour la bicouche de perturbations, et le potentiel "hors cible", les effets. Nous constatons que les résultats en utilisant cette méthode sont en bon accord avec les précédents résultats électrophysiologiques ^12.

Protocole

1. Générer ANTS-remplie liposomes

1. Au jour 1, éliminer le solvant organique à partir des lipides.
2. Retirer du congélateur lipides et laisser s'équilibrer à température ambiante.
3. Ajouter 0,6 mL de 25 mg / ml (1,2-dierucoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine) des lipides dans une solution de chloroforme dans une fiole de 25 ml à fond rond.
4. Continuellement faire tourner la fiole pendant le séchage sous azote, jusqu'à ce que tous le chloroforme a évaporé et une fine pellicule blanche de couches de lipides toute la moitié inférieure de la fiole.
5. Sec dans un dessiccateur sous vide pendant une nuit.

1. Le jour 2, pré....

Discussion

Nous avons démontré un rapide test basées sur la fluorescence pour déterminer le potentiel de modifier bicouche de médicaments et d'autres petites amphiphiles. Les composés qui modifient les propriétés bicouche sont susceptibles d'altérer la fonction des protéines membranaires dans une indirecte, de manière non spécifique, qui peut contribuer à "hors cible" effets des médicaments. Le test exploite la puissance des canaux gramicidine tant que sondes pour des changements de propriétés bicouche ¹²

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ANTS	Invitrogen	A-350
gramicidine	Sigma-Aldrich	G-5002
1,2-diérucoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipid, Inc	850398C
Kit Mini-Extruder	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
Colonne de désalinisation PD-10	Sigma-Aldrich	54805