We introduceren een snelle fluorescentie-gebaseerde test die de mate van fluorescentie quenching als een maat voor gramicidine kanaal activiteit monitoren. De gramicidine kanalen worden gebruikt als moleculaire krachtopnemers op veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen als waargenomen door bilaag spanning eiwitten controleren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gramicidine op basis van fluorescentie test, voor het bepalen van kleine moleculen Potentieel voor het wijzigen van lipide bilaag Properties
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Veel geneesmiddelen en andere kleine moleculen die gebruikt worden voor het moduleren van biologische functie zijn amfifielen dat adsorberen aan de bilaag / oplossing interface en daardoor lipide bilaag eigenschappen te veranderen. Dit is belangrijk omdat membraaneiwitten zijn energetisch gekoppeld aan hun gastheer bilaag door hydrofobe interacties. Veranderingen in de bilaag eigenschappen zo te veranderen membraaneiwit functie, die een indirecte manier voor amfifielen te moduleren eiwit functie en een mogelijk mechanisme voor de "off-target" drug effecten biedt. We hebben eerder ontwikkelde een elektrofysiologische test voor het detecteren van veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen met behulp van lineaire gramicidine kanalen als probes 3,12. Gramicidine kanalen zijn mini-eiwitten gevormd door de transbilayer dimerisatie van twee niet-geleidende subunits. Ze zijn gevoelig voor veranderingen in hun membraan omgeving, waardoor ze krachtig probes voor het monitoren van veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen als waargenomen door bilaag spanning eiwitten. We hebben nu laten zien een fluorescentie assay voor het detecteren van veranderingen in de bilaag eigenschappen met behulp van dezelfde kanalen als probes. De test is gebaseerd op het meten van het tijdsverloop van de fluorescentie quenching van de fluorofoor-loaded grote unilamellaire blaasjes te wijten aan het binnendringen van een quencher via de gramicidine kanalen. We gebruiken de fluorescentie-indicator / quencher paar 8-Aminonaftaleen-1 ,3,6-trisulfonate (mieren) / Tl + die met succes is gebruikt in andere fluorescentie quenching assays 5,13. Tl + doordringt de lipide bilaag langzaam acht, maar passeert gemakkelijk door het uitvoeren van gramicidine kanalen 1,14. De methode is schaalbaar en geschikt voor zowel mechanistische studies en high-throughput screening van kleine moleculen voor bilaag-storende, en potentiële "off-target ', effecten. We vinden dat de resultaten met deze methode zijn in goede overeenstemming met eerdere elektrofysiologische resultaten 12.
Protocol
1. Genereer ANTS gevulde Liposomen
- Op dag 1, te verwijderen organisch oplosmiddel uit lipiden.
- Verwijder de lipiden uit de vriezer en laat het op kamertemperatuur komen.
- Voeg 0,6 ml van 25 mg / ml (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-fosfocholine) lipide in chloroform oplossing om een 25 mL rondbodemkolf.
- Voortdurend draaien de kolf tijdens het drogen onder stikstof, totdat alle chloroform verdampt is en een dun wit laagje lipide lagen de gehele onderste helft van de kolf.
- Droog in een exsiccator onder vacuüm 's nachts.
- Op dag 2, voor te bereiden het monster met de fluorofoor die zullen worden opgenomen i....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben aangetoond dat een snelle fluorescentie-gebaseerde test voor het bepalen van de bilaag wijzigen potentieel van drugs en andere kleine amfifielen. Verbindingen die bilaag eigenschappen te wijzigen zijn waarschijnlijk membraan eiwitten functioneren in een indirecte, niet-specifieke manier te veranderen, eventueel bij te dragen aan "off-target" drug-effecten. De test maakt gebruik van de kracht van gramicidine kanalen als probes voor de veranderingen in de bilaag eigenschappen van 12 die word.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Een voorlopige octrooiaanvraag dat de methoden beschreven in het manuscript omvat is ingediend. De co-uitvinders zijn HII en OSA.
Dankbetuigingen
Wij danken Michael J. Bruno, Radda Rusinova en Jon T. Sack voor vele stimulerende discussies. De financiële steun van NIH, R01GM021342 en ARRA vullen R01GM021342-35S1 en de Josia Macy, Jr Stichting OSA, de Tri-I CMB programma voor HII, en de Iris L. en S. Woodworth Leverett Medical Fellowship Scientist en NIH MSTP verlenen GM07739 voor RK.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| ANTS | Invitrogen | A-350 | |
| gramicidine | Sigma-Aldrich | G-5002 | |
| 1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-fosfocholine | Avanti Polar Lipid, Inc | 850398C | |
| Mini-Extruder kit | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| PD-10 Ontziltingskolom | Sigma-Aldrich | 54805 |
Referenties
- Andersen, O. S. Ion transport through simple membranes. Renal Function. Giebisch, G. H., Purcel, E. F. , The Josiah Macy, Jr. Foundation. New York. (1978).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 1....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
