Gramicidine op basis van fluorescentie test, voor het bepalen van kleine moleculen Potentieel voor het wijzigen van lipide bilaag Properties

Summary

We introduceren een snelle fluorescentie-gebaseerde test die de mate van fluorescentie quenching als een maat voor gramicidine kanaal activiteit monitoren. De gramicidine kanalen worden gebruikt als moleculaire krachtopnemers op veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen als waargenomen door bilaag spanning eiwitten controleren.

Abstract

Veel geneesmiddelen en andere kleine moleculen die gebruikt worden voor het moduleren van biologische functie zijn amfifielen dat adsorberen aan de bilaag / oplossing interface en daardoor lipide bilaag eigenschappen te veranderen. Dit is belangrijk omdat membraaneiwitten zijn energetisch gekoppeld aan hun gastheer bilaag door hydrofobe interacties. Veranderingen in de bilaag eigenschappen zo te veranderen membraaneiwit functie, die een indirecte manier voor amfifielen te moduleren eiwit functie en een mogelijk mechanisme voor de "off-target" drug effecten biedt. We hebben eerder ontwikkelde een elektrofysiologische test voor het detecteren van veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen met behulp van lineaire gramicidine kanalen als probes ^3,12. Gramicidine kanalen zijn mini-eiwitten gevormd door de transbilayer dimerisatie van twee niet-geleidende subunits. Ze zijn gevoelig voor veranderingen in hun membraan omgeving, waardoor ze krachtig probes voor het monitoren van veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen als waargenomen door bilaag spanning eiwitten. We hebben nu laten zien een fluorescentie assay voor het detecteren van veranderingen in de bilaag eigenschappen met behulp van dezelfde kanalen als probes. De test is gebaseerd op het meten van het tijdsverloop van de fluorescentie quenching van de fluorofoor-loaded grote unilamellaire blaasjes te wijten aan het binnendringen van een quencher via de gramicidine kanalen. We gebruiken de fluorescentie-indicator / quencher paar 8-Aminonaftaleen-1 ,3,6-trisulfonate (mieren) / Tl ⁺ die met succes is gebruikt in andere fluorescentie quenching assays ^5,13. Tl ⁺ doordringt de lipide bilaag langzaam ^acht, maar passeert gemakkelijk door het uitvoeren van gramicidine kanalen ^1,14. De methode is schaalbaar en geschikt voor zowel mechanistische studies en high-throughput screening van kleine moleculen voor bilaag-storende, en potentiële "off-target ', effecten. We vinden dat de resultaten met deze methode zijn in goede overeenstemming met eerdere elektrofysiologische resultaten ^12.

Protocol

1. Genereer ANTS gevulde Liposomen

1. Op dag 1, te verwijderen organisch oplosmiddel uit lipiden.
2. Verwijder de lipiden uit de vriezer en laat het op kamertemperatuur komen.
3. Voeg 0,6 ml van 25 mg / ml (1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-fosfocholine) lipide in chloroform oplossing om een ​​25 mL rondbodemkolf.
4. Voortdurend draaien de kolf tijdens het drogen onder stikstof, totdat alle chloroform verdampt is en een dun wit laagje lipide lagen de gehele onderste helft van de kolf.
5. Droog in een exsiccator onder vacuüm 's nachts.

1. Op dag 2, voor te bereiden het monster met de fluorofoor die zullen worden opgenomen in de blaasjes.
2. Hydrateren in 100 mM NaNO _3, 25 mM ANTS (Na zout), 10 mM HEPES. Gebruik HNO _​​3 of NaOH om de pH naar 7,0. Elke ANTS molecuul heeft twee Na ^+, voor een totaal van 150 mM [Na ^+]. Voeg 1,671 mL van elektrolyt tot een 10 mM lipide suspensie te krijgen.
3. Parafilm en vortex ophanging grondig.
4. Bescherm monster van licht met folie en laat het leeftijd bij kamertemperatuur gedurende de nacht.

1. Op dag 3, maken grote unilamellaire blaasjes en verwijder alle fluorofoor van buiten de blaasjes.
2. Sonificeer 1 min in een low-power ultrasoonapparaat.
3. Vries-dooi sample 5-6 keer, telkens met 5 minuten op droog ijs en 5 minuten in warm (~ 50 ° C) water.
4. Extrusie van de lipide suspensie op met een Avanti mini-extruder. Het opzetten van de mini-extruder met een 0,1 urn polycarbonaat filter en filter ondersteunt (zie de extruder handleiding voor details). Extrusie van de vering heen en weer 21 keer zodanig dat de schorsing eindigt op de andere spuit. Wanneer meerdere partijen geëxtrudeerde zijn, altijd onthouden om samples te laden met dezelfde spuit. Tijdens de extrusie de bewolkte eerste lipide suspensie dient te worden bijna doorschijnend (het zal nog geel te wijten zijn aan de ANTS fluorofoor). Als de extrusie plotseling wordt het gemakkelijker en minder druk nodig is om door de filter, kan het filter hebben gescheurd en zal vervangen moeten worden.
5. Verwijder de externe ANTS door het uitvoeren van de geëxtrudeerde schorsing over een PD-10 ontzouten kolom met een zwaartekracht protocol. Evenwicht kolom met 20-30 ml Na-buffer (140 mM NaNO _3, 10 mM HEPES, pH 7,0, vergeet HNO ₃ of NaOH te gebruiken om pH aan te passen). Voeg 1,5 mL van de geëxtrudeerde lipide suspensie aan de kolom en laat het sijpelen binnen Breng het totale volume van het monster tot 2,5 ml door het toevoegen van 1 ml Na-buffer. Nadat de buffer volledig is opgenomen in de kolom en niets lekt uit, elueren de liposomen met 3 ml Na-buffer en het verzamelen van de resulterende steekproef. De gevulde resulterende ANTS LUV stockoplossing moet bevatten ongeveer 4-5 mm lipiden en verschijnen doorschijnend melkachtig wit. Bescherm het monster van licht met folie.
6. Als de voorraad oplossing niet onmiddellijk wordt gebruikt, bewaren bij 13 ° C voor een maximum van 7 dagen. Waarschuwing: niet bevriezen of koelen van de lipide-oplossing onder zijn vloeibare-naar crystal-fase-overgang temperatuur (~ 12 ° C), omdat dit de blaasjes 'integriteit te vernietigen en de fluorofoor zal lekken.

2. Mix Fluorescentie Solution

1. 24 uur voorafgaand aan het gebruik, verdunnen liposomen en incubeer met gramicidine (bij 13 ° C). Evenwicht van gramicidine tussen de lipide vesicles 'innerlijke en uiterlijke monolagen is een langzaam proces, waarbij een lange incubatietijd.
2. Grondig vortex de ANTS gevulde LUV voorraad oplossing als de LUVS hebben een dichtheid van> 1 g / mL en zal daarom sediment in de oplossingen.
3. Meng de ANTS gevulde LUV voorraad 01:20 in Na-buffer. Meng alle liposomen voor gebruik in een dag van experimenten samen in een enkele kolf monster uniformiteit te verbeteren.
4. Scheiden van 3 / 4 van de liposomen en voeg 260 nM gramicidine pre-verdund in DMSO (500 ug / ml).
5. Om de resterende 1 / 4 toe te voegen hetzelfde volume van DMSO (zonder gramicidine) om de concentratie aan oplosmiddeldampen constante in alle monsters.

3. Het opzetten van de fluorescentie Instrument

1. We maken gebruik van een Applied Photophysics SX.20 gestopt-flow spectrofluorometer met temperatuurregeling voor de mate van fluorescentie quenching te meten.
2. Zet de instrumenten op een uur van tevoren om te zorgen voor warm-up. De onderdelen zijn: computer, elektronische regeleenheid, water-bad (zowel koeler en verwarming), lamp voeding en stikstof tank.
3. Stel de opname-omstandigheden met behulp van de Pro-Data SX-software.
4. Stel de monochromator excitatie golflengte 352 nm en de spleet breedte openingen voor excitatie tot 1 / 1.
5. Gebruik een λ = 455 nm high-pass filter om de uitstoot op te nemen.
6. Gebruik de "Pressure Hold"-instelling, die het instrument in staat stelt het handhaven van de stikstof druk tijdens de opname en voorkomt daarmee drukschommelingen (en opname artefacten) tijdens de eerste paar milliseconden.
7. Stel "Time "tot 1 s en de" punten "naar 5000.
8. Gebruik de herhaling doos en pas het aantal herhalingen, we normaal gesproken 9 en 13 herhalingen te gebruiken voor buffer-en quencher runs, respectievelijk.
9. Waterbad temperatuur moet worden ingesteld op 25 ° C, de temperatuur moet worden gecontroleerd in de SX-software.
10. Stel de drive volume van 120 ul, wat betekent dat elke keer dat het instrument een monster loopt, vermengt het 60 pi van elk van de twee spuiten. Met deze instrumentale setup, een 120 ul volume geeft een dode tijd van ≈ 1,2 ms.
11. Stel de hoge spanning (winst) op de fluorescentie detector voor de uitgang van de ANTS-liposoom is om rond de 8. Voor een standaard experimentele mengsel de winst moet worden 400 tot 420 V. Sommige medicijnen zijn tl-licht, zodanig dat ze de fluorescentie-signaal te verzadigen. In deze gevallen dient te krijgen / spanning worden verlaagd.
12. Altijd last van de tl-monster in de linker-spuit en buffer / quencher in de juiste spuit. Zorg ervoor dat u grondig vortex alle monsters die liposomen voor het laden, en wees ervan bewust dat de LUVS met de tijd zullen vestigen in de spuit.

4. Het doen van een experiment

1. Bereid een steekproef van ANTS geladen LUVS met of oplosmiddel of samengesteld, en laden in de spectrofluorometer, samen met een Na-buffer of Tl-quencher (50 mM TlNO _3, 94 mM NaNO _3, 10 mM HEPES bij pH 7,0).
2. Gebruik 1,5 ml verdund ANTS-LUV-oplossing, met of zonder gramicidine, bereid de vorige dag.
3. Voeg de verbinding op de gewenste concentratie of het oplosmiddel voor controles. Houd de oplosmiddelconcentratie tot een minimum en constant in alle monsters. De concentraties zullen moeten worden aangepast met een nieuwe (onbekende) verbinding om de gewenste dosis-respons range te bereiken. Incubeer gedurende 10 minuten bij 25 ° C in het donker.
4. Vortex de LUV monster en laden in de linker spuit. Laad de Na-buffer of Tl-quencher in de juiste spuit.
5. Verwijder zorgvuldig luchtbelletjes uit beide monsters door op de spuiten heen en weer.
6. Zorg ervoor dat beide spuiten zijn gelijk belast vóór het sluiten van de kleppen. Ongelijke belasting zal resulteren in de pre-mixen van oplossingen voor het bereiken van de opname kamer.
7. Voor het eerste monster, noteer de fluorescentie met Na-buffer, herhaal 4 keer, pas dan de hoge spanning (winst) als nodig is, en herhaal 5 keer.
8. Voor de overige monsters te nemen 9 herhalingen met Na-buffer.
9. Vervang de Na-buffer met de Tl-quencher en opnemen van 13 herhalingen.
10. Spoelen met water en ga verder met de volgende monster. Als controles gebruiken we samples met: geen gramicidine en met oplosmiddel, zonder gramicidine en met de maximale concentratie stof, met zowel gramicidine en oplosmiddel.

5. Het analyseren van gegevens

1. Breng de resultaten van de analyse computer. Lees alle gegevens in MATLAB voor het analyseren van. Voor elk monster, gelezen in de buffer en quencher herhaalt, met uitzondering van de eerste vier in elk geval, als die bevatten het mengen van artefacten. Uitgaande van een aandrijving volume van 120 uL het duurt iets minder dan vier schoten volledig duidelijk uit de vorige mengsel uit de gestopt-flow buis.
2. De buffer herhaalt voor alle monsters moeten zeer vergelijkbaar zijn. Als er een belangrijke verschuiving in het fluorescentie-signaal, die afhankelijk is van de verbinding concentratie, dan is de verbinding zelf kan worden fluorescerend en het kan nodig zijn om deze extra fluorescentie-signaal eerste subtract voor het normaliseren van de monsters.
3. Handmatig doen via de sporen en te verwijderen "slechte" herhaalt: herhaalt met spikes of afwijkingen van multi-exponenti te wijten aan het mengen van artefacten en / of bellen.
4. Normaliseren van de quencher herhaalt om de gemiddelde startwaarde van de buffer wordt herhaald voor elk monster. Combineer gemiddelden van alle monsters in een grafiek voor visualisatie.
5. Sporen die zijn opgenomen met geen enkele gramicidine moeten allemaal op elkaar en vertonen vrijwel geen fluorescentie quenching, kan er een langzame vermindering van de fluorescentie-signaal door lekkage van Tl trage ⁺ via de blaasjes bilaag 8. Als het monster zonder gramicidine en geen modifier geeft significant afschrikken, dan is de blaasjes zijn verslechterd en mag niet verder worden gebruikt. Als de monsters met geen gramicidine maar met de modifier significante afschrikken, dan is de modifier verstoort de blaasjes bilaag zodanig dat het mogelijk maakt de fluorofoor of quencher om over de bilaag.
6. Als de verbinding verandert lipide bilaag eigenschappen, zoals waargenomen door gramicidine kanalen, zal de fluorescentie tijdsverloop zichtbaar worden gewijzigd.
7. Voor elk monster, een uitgerekt exponentiële bijv. ⁴⁾ is geschikt om de eerste 200 tot 100 ms van de genormaliseerde fluorescentie quenching curve van de individuele herhalingen en de snelheid ⁴berekend op basis van 2 ms. Gemiddelden en standaarddeviaties zijn berekend voor een gegeven monster van alle individuele herhalingen.
8. Tot slot bepaalt de relatieve verandering in de lessen tarief door het normaliseren naar de dichtstbijzijnde controlemonster in de tijd dat gramicidine en geen modifier heeft.

6. Representatieve resultaten

Figuur 1: De essentie van de fluorescentie doven-gebaseerde test op veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen te detecteren Linksboven:. Een zoom-in op een enkel lipide bolletjes met mieren plus NaNO ₃ aan de binnenkant en NaNO ₃ plus TlNO ₃ aan de buitenkant. Rechtsboven: De fluorescentie-signaal opgenomen met (formulier boven naar beneden) ANTS gevulde blaasjes zonder quencher, met quencher, met quencher en pre-gedoteerd met 87, 260 en 780 nM gramicidine. Bodem: Schematische weergave van de gestopte-flow mengkamer.

Figuur 2: Een schermafdruk van de Pro-Data SX software ter illustratie van de verschillende panels waarnaar verwezen wordt in de beschrijving van de experimentele opstelling.

Figuur 3:. Multiple herhalen bepalingen van het fluorescentie signaal van ANTS geladen LUVS met Na-buffer De eerste vier herhalingen worden altijd uitgesloten, want ze bevatten het mengen van artefacten. De slang aansluiten van de steekproef spuiten om het mengen cel een bepaald volume, dus de eerste paar herhalingen zal ons een lezing van wat er eerder in de slang: water voor herhaling 1 en 2, een combinatie van water en monster te herhalen 3, meestal steekproef voor herhaling 4, en enkel monster voor de overige herhalingen.

Figuur 4:. Multiple herhalen bepalingen van het fluorescentie signaal van ANTS geladen LUVS met Na-buffer en met Tl-quencher De eerste vier herhalingen zijn verwijderd uit beide voorwaarden. Daarnaast is het voor de Tl-quencher metingen, herhaal acht dient te wijten aan artefacten, het meest waarschijnlijk luchtbellen worden verwijderd.

. Figuur 5: Effect van capsaïcine (Cap) op het tijdsverloop van ANTS fluorescentie quenching (A) De genormaliseerde fluorescentie signaal over een s, grijze stippen duiden de resultaten van alle herhalingen (n> 5 per conditie), rode lijnen geven het gemiddelde van alle herhaalt. (B) De eerste 100 ms, grijze stippen duiden de resultaten van een enkele herhaling voor elke aandoening, rode lijnen zijn uitgerekt exponentieel past (2 - 100 ms) aan die herhalingen. De gestippelde blauwe lijn geeft de 2 ms merk, het tijdstip waarop het tarief van quenching wordt bepaald. In zowel de A en B van de bovenste spoor geeft de resultaten weer in de afwezigheid van Tl ^+, de komende twee sporen geven resulteert in de afwezigheid van GA, met Tl ⁺ ± Cap; de vier lagere sporen tonen de resultaten met 260 nM GA en Tl ^+, waar de nummers aan te duiden [Cap] in uM. De tarieven van quenching voor 0, 10, 30 en 90 uM Cap, zoals bepaald door de snelheid van een uitgestrekt exponentiële, zijn 36 ± 6, 69 ± 6, 85 ± 8 en 247 ± 27 (gemiddeld ± sd, n> 8) , respectievelijk.

Discussion

We hebben aangetoond dat een snelle fluorescentie-gebaseerde test voor het bepalen van de bilaag wijzigen potentieel van drugs en andere kleine amfifielen. Verbindingen die bilaag eigenschappen te wijzigen zijn waarschijnlijk membraan eiwitten functioneren in een indirecte, niet-specifieke manier te veranderen, eventueel bij te dragen aan "off-target" drug-effecten. De test maakt gebruik van de kracht van gramicidine kanalen als probes voor de veranderingen in de bilaag eigenschappen van ¹² die worden gedetecteerd door de bilaag-spanning eiwitten. De resultaten verkregen met behulp van de fluorescentie-gebaseerde test zijn in goede overeenstemming met de resultaten van single-channel gA experimenten ^12, wat aangeeft dat deze methode kan worden gebruikt voor mechanistische studies, alsook voor het screenen van chemische molecuulcollecties. Met behulp van de huidige configuratie van de test kunnen we testen tientallen van verbindingen een dag, dat is een-op-twee ordes van grootte hoger doorvoer dan mogelijk met behulp van de single-channel benadering. Er zijn geen fundamentele snelheidsbeperkende stappen in de fluorescentie-gebaseerde test, wat betekent dat het kan worden uitgebreid om te draaien in echte high-throughput-modus. Het is mogelijk om de test van de elektrolyt-oplossingen variëren en / of verschillende lipide samenstelling gebruiken voor de LUVS '. Het is opvallend dat enkele lipide composities kan scheiden wanneer gedroogd, waarbij een snelle uitwisseling solvent systemen in plaats van droog / hydratatie stappen ^7.

Het is nog onduidelijk of er een causaal verband tussen het verhogen van lipofiliteit van drug leads en het verhogen van natuurlijk verloop in de ontwikkeling van geneesmiddelen ^10,11,17, en zo ja, wat zijn de onderliggende mechanisme (s)? Niettemin, omdat membraaneiwitten zijn vaak gereguleerd door veranderingen in hun omgeving membraan ^2, zou het verstandig om te testen of amfifiele drugs en ​​drugs leidt relevante lipide bilaag eigenschappen te veranderen en, zo ja, tegen welke concentraties? Amfifiele adsorptie aan de lipide dubbellaag zal uitputten van de waterige fase, dus de relevante concentratie is de vrije concentratie in de waterfase die kan worden ordes van grootte kleiner dan de nominale concentratie in het systeem, bijvoorbeeld ^6,9,16. Als een molecuul met de gewenste (biologische) effecten optreden bij concentraties waar het verandert bilaag eigenschappen, is het belangrijk wordt om onderscheid te maken tussen de "niet-specifieke", bilaag-gemedieerde veranderingen in de membraaneiwit functie, in tegenstelling tot de directe effecten als gevolg van (hoge affiniteit ) binding aan een of meer doelwit eiwitten. Het kennen van de bilaag-modificerende neiging van een geneesmiddel te leiden, ontdekte via de conventionele high-throughput screening, is daarom waarschijnlijk belangrijk zijn voor beslissingen over de verdere ontwikkeling ervan.

Elke amfifiele zullen veranderen op een gegeven concentratie een bilaag eigendom. Belangrijke overwegingen dan ook te worden: bij welke concentratie, en zijn de veranderingen in de bilaag eigenschappen waargenomen door (bilaag-spanning) membraaneiwitten? Hier hebben we gebruik maken van de mogelijkheid van gramicidine van kanalen door transbilayer dimerisatie ¹⁵ te vormen. Dit maakt ze nuttig probes voor de energetische koppeling tussen lipidendubbellagen en bilaag-embedded eiwitten, en voor het verkennen van de vraag of kleine moleculen bilaag eigenschappen die worden gedetecteerd door de membraaneiwitten te veranderen. De test is snel, betrouwbaar en schaalbaar en daardoor geschikt voor zowel biofysische studies en voor het screenen van chemische moleculen voor geneesmiddelen met potentiële bilaag-storende effecten.

Voor aanvullende informatie over de test, controle van de effectiviteit van de test, en vergelijking met de single-channel elektrofysiologie zie ^12.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTS	Invitrogen	A-350
gramicidin	Sigma-Aldrich	G-5002
1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipid, Inc	850398C
Mini-Extruder kit	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
PD-10 Desalting column	Sigma-Aldrich	54805