Summary
Denna video visar hur man framkalla autoimmuna hypophysitis i SJL möss och hur man kan bedöma dess svårighetsgrad av histopatologi.
Abstract
Autoimmuna hypophysitis kan reproduceras experimentellt genom injektion av hypofysen proteiner blandat med en adjuvans i mottagliga möss 1. Musmodeller ge oss möjlighet att studera hur sjukdomar utvecklas, ofta ger en bra replik av samma processer som sker hos människor. För vissa autoimmuna sjukdomar, som typ 1A-diabetes, det finns modeller (NOD musen) som spontant utvecklar en sjukdom som liknar den mänskliga motsvarighet. För många andra autoimmuna sjukdomar måste dock den modell som ska framkallas experimentellt. En gemensam strategi i detta avseende är att injicera musen med en dominerande antigen från orgeln som studeras. Till exempel, utredare intresserad av autoimmun tyreoidit injicerar möss med tyreoglobulin 2, och de som är intresserade av myastenia gravis injicera dem med acetylkolin-receptorn 3. Om autoantigen för en viss autoimmun sjukdom är inte känd, utredare injicera en råprotein utdrag ur orgeln är målet för den autoimmuna reaktionen. För autoimmuna hypophysitis, patogena autoantigen (s) återstår att identifiera 4, och därmed en rå hypofysen protein preparatet används. I denna video artikeln visar vi hur du kan få experimentell autoimmun hypophysitis i SJL möss.
Protocol
Experimentell Protokoll
När hypofysen immunogen är beredd (se anknytande artikel) är det injiceras subkutant i SJL möss (The Jackson Laboratories, lager 000.686). En andra identiska injektionen upprepas 7 dagar senare. Möss används sedan för att samla in vivo och efter slakt resultat.
Steg 1. Subkutan injektion av hypofysen immunogen i SJL möss
Möss är först bedövas genom att injicera 0,5 ml 20 mg / ml 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin, TCI Amerika, T-1420) intraperitonealt. Möss är sedan injiceras subkutant med 100 ìl av hypofysen emulsionen att, såsom anges i sällskap JUPITER 2181 Artikeln innehåller 1 mg hypofysen extrakt och 0,25 mg av kompletta Freunds adjuvans. Emulsionen injiceras i vänster dorsala bakben region ((50 mikroliter) och rätten ljumsk-regionen (50 mikroliter). Hypofysen emulsion sprutas igen på dag 7 i den motsatta sidor (50 l i rätt ryggen bakbenet regionen och 50 l i vänster inguinal regionen). Möss övervakas dagligen de första tre dagarna och sedan varje vecka fram till dagen för offer, vilket är normalt 28 dagar efter första immunisering.
Steg 2. Insamling av in vivo-resultat: Blod-analyser
Vävnaden oftast används för att bedöma experimentella resultat medan möss är fortfarande vid liv är blod. Blod är rutinmässigt tas 14 dagar efter den första immunisering att mäta serumnivåer av hypofysär antikroppar eller andra markörer såsom cytokiner och kemokiner.
Blod samlas in från levande möss som följer. Möss hålls fast av nackskinnet och baksidan av käkbenet finns. När baksidan av käkbenet ligger, är 4 mm lansetter används för att tränga igenom submandibular vaskulära bunten. När blodet samlas in, sätta press på den på området med hjälp av en spritsudd för att undvika ett hematom. Insamlade blodet centrifugeras vid 2000 g under 20 minuter, och förvaras vid -80 ° C till dess används.
Steg 3. Insamling av post mortem-resultat: Hypofys histopatologi
Möss är oftast offrat 28 dagar efter första immunisering. Kardinalen Funktionen behövs för att fastställa diagnosen EAH är infiltration av hypofysen av hematopoetiska mononukleära celler.
Möss är avlivas genom att placera dem i en lufttät kammare av plast som är perfusion med CO 2. Möss hålls i kammaren för totalt 8 minuter. Efter dödshjälp är hypofysen samlas som beskrivs i sällskap artikeln. En sjuk hypofysen verkar svullna och fastare anhängare till den omgivande dura mater. Sharp pincett används för att lossa hjärnhinnan som omger hypofysen. När hypofysen rör sig fritt på sphenoid ben, ena änden av hypofysen är förstått med pincett och hypofysen är noggrant lyfts. Körteln placeras sedan i ett mikrocentrifugrör innehåller Beckstead är fixativ 5. Hypofysen är fast över natten, insvept i linspapper och placeras i en kassett. De körtlar bearbetas sedan med hjälp av följande protokoll:
| Station nummer | Reagens | Tid i minuter | Temperatur (Celsius) |
| 1 | 70% alkohol | 5 | 25 |
| 2 | 70% alkohol | 15 | 25 |
| 3 | 95% alkohol | 15 | 25 |
| 4 | 95% alkohol | 15 | 25 |
| 5 | 100% alkohol | 15 | 25 |
| 6 | 100% alkohol | 7,5 | 25 |
| 7 | 100% alkohol | 7,5 | 25 |
| 8 | xylen | 20 | 25 |
| 9 | xylen | 20 | 25 |
| 10 | xylen | 25 | |
| 11 | fotogen | 30 | 58 |
| 12 | fotogen | 5 | 58 |
| 13 | fotogen | 5 | 58 |
Efter bearbetning är hypofys inbäddade i paraffin och minst 5 bredvid varandra sektioner (5-ìm tjock) skärs från varje körtel. Efter snittning, är de körtlar färgas med hematoxylin och eosin, och analyseras för att kvantifiera de mononukleära infiltration. Avsnittet med de allvarligaste infiltration är vald för att göra poäng. Svårighetsgraden görs bygger på en subjektiv uppskattning av omfattningen av främre hypofys utbyte eller förstörelse av immunceller: grad 0, ingen sjukdom, lönegrad 1, 2% -20% inblandning, klass 2, 20% -30%, grad 3, 30% -50%, årskurs 4, 50% -90%, årskurs 5, mer än 90%. Alla delar är poängsätts av två individer förblindade till källan av avsnitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fyra tekniker har rapporterats framkalla hypophysitis hos försöksdjur. Tekniken beskrivs i denna artikel, som är den injektion av hypofysen proteiner blandat med Freund s adjuvans, är den äldsta, med anor från 1967 6, och har förbättrats på senare tid 1. Andra tekniker är injektion av lösliga glykoproteiner rubellavirus 1992 7, stereotaktisk injektion av ett adenovirus direkt i hypofysen i 2002 8, och transplantation av hypofys från en råtta stam under njuren kapsel en annan råtta stam i 2010 9 . Den största fördelen med Freund s adjuvans tillvägagångssätt är att det är mindre invasiva, mer konsekvent och framför allt, mer exakt i att förmå en sjukdom som liknar den mänskliga motsvarighet. Tekniken beskrivs i denna video artikeln ger en reproducerbar modell av hypophysitis, som kan användas av utredare för att förbättra vår förståelse av denna fascinerande sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag DK080351 till PC, och genom en generös gåva av Terry och Kristine Gore familj.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SJL mice (The Jackson Laboratories) | stock 000686 | ||
| 2,2,2-Tribrom–thanol (Avertin) | TCI America | T-1420 | |
| Beckstead’s fixative |
References
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. , (2008).
- Twarog, F. J., Rose, N. R. The production of thyroid autoantibodies in mice. J Immunol. 101, 242-2450 (1968).
- Patrick, J., Lindstrom, J. Autoimmune response to acetylcholine receptor. Science. 180, 871-872 (1973).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
- Beckstead, J. H. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum. J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).
- Levine, S. Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland. Science. 158, 1190-1191 (1967).
- Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy. Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).
- Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis. J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).
- Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K. Adenohypophysitis in rat pituitary allografts. Int J Exp Pathol. , (2010).
