Summary
פיתחנו וקטור lentiviral שיש לה, בנוסף LTR תאת מגיב, את אלמנט Rev-תגובה (RRE) כי ניתן לווסת את ביטוי הגן הכתב בצורה HIV-1 ו-תאת Rev-מותנה. וקטור מאפשר את זיהוי ספציפי של שכפול HIV בתאים חיים באמצעות ביטוי ה-GFP.
Abstract
רוב HIV-תגובה וקטורים ביטוי מבוססים על האמרגן HIV, לחזור מסוף ארוך (LTR). בעוד מגיבים חלבון ה-HIV מוקדם, תאת, LTR הוא גם מגיב למצבים ההפעלה הסלולרית לפעילות הכרומטין המקומי שבו האינטגרציה התרחשה. זה יכול לגרום ל-HIV פעילות עצמאית גבוהה, הגביל את השימושיות של הכתב LTR מבוססי תאים סימן נשאיות 1,2,3. הנה, אנחנו נבנה וקטור ביטוי lentiviral שיש לה, בנוסף LTR תאת-תגובה, מספר רב של רצפי דנ"א HIV הכוללים את אלמנט Rev-HIV בתגובה אתרי שחבור 4,5,6. וקטור שולב וירוס כתב lentiviral, המתיר גילוי ספציפי מאוד של שכפול ה-HIV בקרב אוכלוסיות תא חי. הפעילות של וקטור נמדדה על ידי ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). היישום של וקטור זה כפי שדווח כאן מציעה גישה חלופית הרומן השיטות הקיימות, כגון PCR באתרו או מכתים HIV אנטיגן, לזהות נשאי HIV לתאים. וקטור יכול גם לבטא גנים טיפוליים לניסויים קליניים בסיסיים או למקד נשאי HIV לתאים.
Protocol
1. Transfection של פלסמידים עבור הפקה של Rev-מותנה חלקיקים lentiviral
הגדרת: Rev-GFP תלוי וקטור lentiviral, pNL-GFP-RRE-SA, תוארה בעבר 4,5,6. כדי להרכיב לתוך חלקיק נגיפי, הפלסמיד היה contransfected לתוך HEK293 בתאי T לבנות עם HIV-1 אריזה, pCMVΔ8.2 (בתנאי בחביבות על ידי ד"ר Dider Trono), וכן פלסמיד שנשא את גליקופרוטאין VSV-G (pHCMV-G) . Transfection בוצע בשיטת סידן פוספט.
הכנת מאגרים: 10 X בהרוורד (Hepes בופר) הוכנה על ידי המסת 5 גרם של Hepes, 8 גרם של NaCl, 0.37 גרם של KCl, 1 גרם דקסטרוז, 0.103 גרם Na 2 HPO 4 (anhydrous) ב 100 מ"ל של H 2 O. The10 Aliquot X בהרוורד חיץ לתוך 1 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 ° C. בזמן transfection, להמיר את 10 X 2 X בהרוורד כדי בהרוורד עם H 2 O (1: 5 דילול), ולהתאים את ה-pH על בין 7.05-7.12. (ל -10 מ"ל 2 X בהרוורד, זה בדרך כלל דורש כ 50 μL של 1M NaOH). סנן לעקר את החיץ 2X בהרוורד על ידי עובר דרך 0.22 מיקרומטר Millipore הסינון. חיץ CaCl 2 נעשתה על ידי המסת CaCl 2 ב 10 Hepes מ"מ עד 2M ריכוז הסופי. התאם ל-pH 5.8, מסנן לעקר את החיץ ולאחסן ב 4 ° C.
נוהל:
- יום אחד לפני transfection, זרע 2 x 10 6 תאים HEK293T ב 100 מ"מ, צלחת פטרי, ולגדל תאים לילה 10 מ"ל DMEM + 10% FBS על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- למחרת, להסיר supernatant מתאי ולהחליף עם 5 מ"ל טרי DMEM + 10% FBS, התרבות תאים ברציפות במשך 4 שעות.
- בתוך צינור קלקר 5 מ"ל, להוסיף 480 μL חיץ 2X בהרוורד.
- בתוך צינור פוליסטירן השני 5 מ"ל, להוסיף 60 μL 2M CaCl 2 חיץ, ה-DNA פלסמיד, ו transfection TE חיץ (1 mM טריס, 25 mM EDTA, pH 8.0) עד נפח כולל של 480 μL. עבור צלחת פטרי כל פלסמידים יש להוסיף ביחס של 10 מיקרוגרם של pNL-GFP-RRE-SA, 7.5 מיקרוגרם של pCMVΔR8.3, ו 2.5 מ"ג של pHCMV-G.
- מוסיפים את פלסמיד דנ"א CaCl 2 dropwise תערובת של הצינור 2 בהרוורד X, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. המשקע בסדר יהוו.
- מוסיפים את μL 960 של התערובת dropwise ידי פיפטה אל התאים. לדגור על 37 ° C CO, 5% 2 לילה.
- למחרת, להסיר את supernatant ולהוסיף טרי 10 מ"ל DMEM + 10% FBS, ברציפות דגירה התאים ב 37 ° C CO, 5% 2 לילה.
- בשלב transfection 48 שעות לכתוב, הקציר וירוס על ידי הסרת supernatant והעברתו לתוך צינורות 50 מ"ל סטרילי. הוסף 10 מ"ל טרי טרי DMEM FBS + 10% לתוך צלחת פטרי כל ולהמשיך תרבות בין לילה. חנות supernatant וירוס ב 4 ° C.
- המשך הקציר transfection 72 שעות שלאחר ידי איסוף supernatant. מערבבים את כל supernatants ו בצנטריפוגה supernatants XG ב 500 במשך 15 דקות כדי גלולה ולסלק פסולת התא.
- Supernatant נאספו מסונן באמצעות מסנן Millipore 0.22 מיקרומטר. הווירוס היה מרוכז יותר באמצעות גודל הדרה עמודות.
2. תתרכז חלקיקים נגיפיים ולקבוע titer ויראלי
- חלקיקים נגיפיים רוכזו על ידי טור בגודל הרחקה (100,000 מגוואט מנותקים, Centricoin). Supernatant ויראלי נטען לתוך הטור, ו centrifuged XG ב 6000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- Supernatant ויראלי מרוכז נאסף, aliquoted, ומאוחסנים ב -80 ° C.
- Titer ויראלי נקבע על ידי זיהום של TNF-שטופלו, HIV-1 קו התא חיובי Jacket, J1.1 7. היו תאים בתרבית בצלחת 96 גם ב 2.5 x 10 5 תאים לכל מ"ל (100 מ"ל סה"כ נפח), וכן נגוע 100 מ"ל של דילול סדרתי vNL-GFP-RRE-SA במשך שבוע. כייל (TCID50) של החלקיקים הוערך על ידי ספירת בארות GFP חיובית בעקבות השיטה של ריד Muench 8.
3. סימון HIV-1 תאים חיובי עם החלקיקים lentiviral, vNL-GFP-RRE-SA
הגדרת: תא T מסוג CD4 אנושי קו, CEM-SS, היה נגוע הראשון עם HIV-1. ב 48 השעות שלאחר הזיהום, התאים היו superinfected עם חלקיקי lentiviral, vNL-GFP-RRE-SA. בעקבות superinfection עוד יומיים, GFP חיובי תאים נותחו על ידי cytometry הזרימה. כמו שליטה, HIV-1 נגוע CEM-SS התאים נדבקו זהה עם vNL-GFP-RRE-SA. רק ב-HIV-1-נגועים CEM-SS תאים הולידה את ה-GFP בתאים חיוביים אך לא HIV-1 נגוע CEM-SS תאים.
נוהל:
- שעתיים לפני ההדבקה, להוסיף polybrane לריכוז סופי 4 מ"ג / מ"ל. ספירת תאים ולקחת 2 x 10 5 תאים עבור כל זיהום. להדביק תאים עם נ"ג 200 (p24) של HIV-1-3 NL4 למשך 2 שעות.
- כביסה תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות, resuspendתאים לתוך 2 x 10 5 תאים / מ"ל, והתרבות 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
- ספירת תאים ולקחת 2 x 10 5 תאים לכל זיהום vNL-GFP-RRE-SA. מוסיפים 100 מ"ל של vNL-GFP-RRE-SA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שטפו תאים resuspend לתוך 2 x 10 5 תאים / מ"ל.
- בצע ניתוח תזרים cytometry ב superinfection 48 שעות הודעה. תאים נגועים היו pelleted ו resuspended לתוך paraformaldehede 500 מ"ל 1%, מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ניתח אז על נתח FACScan (בקטון דיקנסון).
4. נציג תוצאות
אם הניסויים מבוצעים בהצלחה, אוכלוסייה גדולה של GFP יזוהו בתאים HIV-1-נגועים CEM-SS על ידי cytometer את הזרימה, בעוד שליטה, התאים GFP חיובי לא יזוהו ב HIV-1 נגוע CEM-SS תאים.
אם הניסויים מבוצעים בהצלחה, וקטור Rev-מותנה lentiviral, vNL-GFP-RRE-SA, יאפשר זיהוי ספציפי מאוד של איידס משכפלים לחיות אוכלוסיות תאים, באמצעות מדידה של חלבון פלואורסצנטי ירוק הביטוי (GFP). בדוגמה זו, שנקטפו CEM-SS תאים הוכתמו נוגדן PE-שכותרתו עכברוש חד שבטי כנגד CD24 העכבר, HSA, ונותחו לאחר מכן על cytometer זרימה הן HSA וביטוי GFP.
באיור 1. כפי שמוצג כאן, אוכלוסייה גדולה של GFP זוהה HIV-1-נגועים בתאי superinfected עם vNL-GFP-RRE-SA (איור 1 ג'). לעומת זאת, התאים GFP חיובי לא התגלו או CEM-SS תאים HIV-1 נגוע ללא superinfection lentiviral (איור 1 א) או HIV-1 לתאים נגוע עם superinfection lentiviral (איור 1b).
Discussion
כמו עם תאת תלויי וקטורים התפתחה בשלב מוקדם יותר ביטוי, מערכת Rev המתואר כאן הוא ניצול של תהליך התפתח HIV. הכללת Rev-התלות הופכת את וקטור מבוססי LTR הביטוי תלויה מאוד בנוכחות של שכפול ה-HIV. היישום של וקטור זה כפי שדווח כאן, וירוס ה-HIV תלויי הכתב, מציעה גישה חדשה הרומן לזהות נשאי HIV לתאים. וקטור מאפשר בדיקה של תאים חיים, יכול לבטא את כל הגן לניסויים בסיסי או קליני, כמו lentivirus פסאודו הקלדת יש גישה סוגי תאים ורקמות ביותר.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
העבודה נתמכה בחלקה על ידי שירות הבריאות הציבורי מענק 1R01AI081568 מ NIAID ל י.ו. ועל ידי תרומות נדיבות של תורמים הרוכבים של רייד 2009 איידס NYCDC מאורגן על ידי מ 'רוזן Day2 בע"מ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | |||
| 37°C 5%CO2 incubator | |||
| Flow cytometer | FACSCalibur | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allega®6KR | |
| 4°C regrigerator | |||
| -20°C refrigerator | |||
| -80°C refrigerator | |||
| Cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer® AutoT4 | |
| HEK293T cell line | National Institutes of Health | ||
| CEM-SS cell line | National Institutes of Health | ||
| Jurkat cell line J1.1 | National Institutes of Health | ||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438-018 | |
| HIV-1NL4-3 | prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA | ||
| pNL-GFP-RRE | copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3 | ||
| pNL-GFP-RRE-SA | Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE | ||
| pCMVΔ8.2 | provided by Dr. Dider Trono | ||
| pHCMV-G | |||
| 10 x HBS (Hepes Buffered Saline) | Invitrogen | 11344-041 | |
| 2M CaCl2 buffer | Invitrogen | S-013-154-10 | |
| 1% paraformaldehy | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Bleach | |||
| 50ml Falcon tubes | BD Biosciences | 358206 | |
| 5ml round bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| 0.45μM Millipore filter | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 0.20μM Millipore filter | EMD Millipore | SLFG85000 | |
| 100mm Petri-dish | Sigma-Aldrich | CLS430588 | |
| Size-exclusion column (100,000MW cut off) | Sartorius AG | VS2041 | |
| 2ml frozen tube | Axygen Scientific | SCT-200 | |
| 96-well plate | BD Biosciences | 353227 | |
| 1.7mL Microcentrifuge Tube | Axygen Scientific | MCT- 175-C |
References
- Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus. EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).
- Merzouki, A. HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).
- Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects. AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).
- Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent lentiviral expression vector. Retrovirology. 4, 12-12 (2007).
- Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. Rev-dependent indicator T cell line. Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).
- Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis. Retrovirology. 5, 36-36 (2008).
- Perez, V. L. An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation. Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
