Summary
Denna video illustrerar den allmänna tekniker som används för bak Anopheles gambiae i laboratoriet. Metoderna för vård av laboratorie myggor visas genom alla skeden av organismens livscykel från larv till puppa till blod-utfodring vuxna.
Abstract
Detta protokoll beskriver mygga uppfödning i insectary. Den insectary Rummen är kvar vid 28 ° C och ca 80% luftfuktighet, med en 12 tim. dag / natt cykel. För denna procedur måste du mygga burar, 10% steril sackaroslösning, pappershanddukar, bägare, Whatman filterpapper, matare glas, blod och serum, vattenbad, parafilm, destillerat vatten, ren plastbrickor mygga mat (som beskrivs nedan), myggnät för att täcka facken, vakuum, och en samling kammare för att samla vuxna.
Protocol
Mosquito mat:
- Mat A: jordat fiskmat (Aquaricare). En liten nypa behöver läggas till.
- Mat B: jordat CAT mat (Purina). En liten nypa behöver läggas till.
- Mat C: kattmat (Purina). Två tabletter behöver läggas till.
Blod:
Djur eller blod kan användas för att bakre myggor. Färskt blod samlas in med en spruta och sätter i en steril 15 ml Falcon rör innehållande 1 ml CPD (antikoagulantia) för varje 10 ml blod, blandas försiktigt och centrifugeras vid rumstemperatur vid 2000 rpm i 5 min. Supernatanten slängs noga med att ta bort buffy coat som består av andra blodkroppar (t ex WBC). RBC pellets är sedan upphängd i en lika stor volym RPMI medium genom pipettering och ytterligare tvättas i detta medium tre gånger. Efter den sista tvätten, är pelleterat röda blodkropparna suspenderade i en lika stor volym RPMI medium och lagras vid 4 ° C (kan förvaras i 8-10 dagar). Strax före utfodring, är RBC (i RPMI) centrifugeras (2000 rpm i 5 min) till pellets ner celler och packade RBC är suspenderade i serum (O + humanserum) för att erhålla en 40% hematokrit. Blodet måste hållas vid 37 ° C alltid för utfodring.
DAG 1:
- Den 3-5 dagar gammal vuxen hona myggor utfodras med blod för att lägga ägg.
- För blod utfodring, är en konstgjord membran (parafilm) som matar metod som används enligt följande:
- Röda blodkroppar (se ovan för blod beredning) blandas med värmeinaktiverad serum för att få en ~ 40% hematokrit (packad RBC 40% och serum 60%). Denna läggs till glaset mataren.
- Mataren är ansluten till en varmt vatten-jacka (37 ° C), och placeras på buren så att myggen tillgång till membranets yta.
- Myggorna får foder till ~ 30 minuter.
DAG 3:
- Honorna lägger ägg två dagar efter att de livnär sig på blod. En liten filtrerpapper insvept i en konisk form läggs i en liten bägare med destillerat vatten, se till att filterpapper blir fuktig. Bägaren hålls inne i buren över natten för myggorna att lägga ägg.
DAG 4:
- Den filtrerpappret med mygga ägg placeras i en plastbricka med ~ 300 ml destillerat vatten. En nypa av mat A skall läggas till facket och ägg får kläcks till larver under de närmaste dagarna.
Dagar 5 - 8:
- Växande larver matas varje dag med två tabletter av mat C och övervakas för densitet och befolkning. På den åttonde dagen (5 dygn gamla larver), är larverna befolkningen utspädd från ett fack till ~ 10 brickor, med en nypa av mat A och två tabletter av mat C i varje magasin. (~ 30 min)
Dagar 9 - 12:
- Larverna matas varje dag med mat C. Den 12 dag (9 dygn gamla larver), är vattnet ändras med färskt vatten och mat läggs (en nypa mat B och två tabletter av mat C). Den puppor börjar utvecklas i detta skede. Brickorna är täckta med nät för att undvika läckage av vuxna. (~ 8-10 min)
Dag 13 - 15:
De puppor tillåts växa fram med vuxna för de närmaste 2 - 3 dagar. Mat ges varje dag för att larverna / puppor genom att försiktigt ta bort nätet för att undvika att fly för vuxna.
DAG 16:
- De vuxna samlas i en bur med en aspirator kopplad till vakuum. Buren består av en liten 100 ml flaska med en bomullspinne veke som är indränkt med 10% sackaros (autoklaveras) och en pappershandduk foder på botten för att suga eventuella socker spill som kan ske under bur hantering. (~ 30-40 min)
Dag 17 - 21:
- De vuxna (både män och kvinnor) sedan förvaras i insectary rum för 4-5 dagar, utfodras med 10% sackaros innan de åter blod-fed att börja nästa cykel. Samma myggor kan användas för att lägga ägg mer än en gång.
- De myggor som inte behövs för experiment eller uppfödning kan dödas genom att placera buren i en frys. Den använda brickor och burar behöver rengöras och torkas innan de kan användas igen.
OBS: Det kan finnas vissa variationer i mygga produktionssystem och olika laboratorier kan ha olika tekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Food A | Aquaricare | Grounded fish food. A small pinch needs to be added. | ||
| Food B | Purina | Grounded cat food. A small pinch needs to be added. | ||
| Food C | Purina | Cat food. Two tablets needs to be added | ||
| RBC | prepared red blood cells: 40% hematocrit in human serum | |||
| RPMI | Medium | |||
| CPD | anticoagulant | |||
| serum | O+ human serum | |||
| Mosquito feeder | ||||
| parafilm | ||||
| Anopheles gambiae | mosquitos | |||
| 10% sucrose | mosquito food | |||
| insectary |
References
- Bangs, M. J., Soelarto, T., Barodji,, Wicaksana, B. P., Boewono, D. T. Colonization of Anopheles maculatus from Central Java, Indonesia. J Am Mosq Control Assoc. 18, 359-363 (2002).
- Beier, M. S., Beier, J. C., Merdan, A. A., el Sawaf, B. M., Kadder, M. A. Laboratory rearing techniques and adult life table parameters for Anopheles sergentii from Egypt. J Am Mosq Control Assoc. 266, 266-270 (1987).
- Benedict, M. Q. Care and maintenance of anopheline mosquitoes, The molecular biology of disease vectors: A methods manual. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. , Champman & Hall. London. 3-12 (1997).
- Casanges, A. H., Mcgovran, E. R., Chiles, J. V. Rearing of Anopheles quadrimaculatus Say and Aedes aegypti (L.) in the laboratory. Mosq News. 9, 112-117 (1949).
- Merritt, R. W., Dadd, R. H., Walker, E. D. Feeding behavior, natural food and nutritional relation ships of larval mosquitoes. Annual Rev. Entomol. 37, 349-376 (1992).
- Nasirian, H., Ladonni, H. Artificial bloodfeeding of Anopheles stephensi on a membrane apparatus with human whole blood. J Am Mosq Control Assoc. 22, 54-56 (2006).
- Ng'habi, K. R., John, B., Nkwengulila, G., Knols, B. G., Killeen, G. F., Ferguson, H. M. Effect of larval crowding on mating competitiveness of Anopheles gambiae mosquitoes. Malar J. 30 (4), 49 (2005).
- Stobart, R. H. Factors affecting the control of body volume in the larvae of the mosquitoes Aedes aegypti and Aedes detritus. Edw. J. Exp. Boil. 54, 67-82 (1971).
