En este artículo se pretende describir en forma gradual el uso común In vitro Métodos de evaluación utilizados en el estudio de la célula de Schwann-asrtocyte interacciones.
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Artículo de método
El análisis de Schwann-astrocito interacciones utilizando In Vitro Ensayos
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células de Schwann son una de las celdas habitualmente utilizadas en las estrategias de reparación después de lesiones de la médula espinal. Las células de Schwann son capaces de soportar la regeneración axonal y el brote de crecimiento secretan factores de crecimiento de 1,2 y ofrecer la promoción de tres moléculas de adhesión y moléculas de la matriz extracelular 4. Además se mielinizar los axones mielina en el sitio de la lesión 5.
Sin embargo después del trasplante, las células de Schwann no migran desde el sitio de implante y no se mezclan con los astrocitos de acogida 6,7. Esto se traduce en la formación de una frontera clara entre las células de Schwann y astrocitos, creando un obstáculo para los axones en crecimiento tratando de salir de la parte posterior del injerto en el tejido del huésped proximal y distal. Los astrocitos en contacto con las células de Schwann también se someten a la hipertrofia y un máximo de regular las moléculas inhibidoras 08.13.
En ensayos in vitro se han utilizado para modelar la célula de Schwann, astrocitos y las interacciones han sido importantes en la comprensión de los mecanismos subyacentes al comportamiento celular.
Estos ensayos in vitro son los límites del ensayo, donde se hizo un co-cultivo con dos células diferentes con cada tipo de célula que ocupan territorios diferentes con sólo una pequeña brecha que separa los dos frentes de la célula. Como las células se dividen y emigran, los dos frentes celular se acercan el uno al otro y finalmente colisionan. Esto permite que el comportamiento de las dos poblaciones celulares que se analizan en la frontera. Otra variante de la misma técnica que consiste en mezclar las dos poblaciones celulares en la cultura y con el tiempo los dos tipos de células segregan con las células de Schwann se agruparon como islas en medio de los astrocitos en conjunto la creación de múltiples Schwann, astrocitos límites.
El segundo ensayo utilizados en el estudio de la interacción de dos tipos de células es el ensayo de la migración, donde puede ser rastreado movimiento celular en la superficie del tipo de células en monocapa 14,15. Este ensayo se conoce comúnmente como ensayo cubreobjetos invertido. Las células de Schwann se cultivan en pequeños fragmentos de vidrio y se invierten boca abajo sobre la superficie de las monocapas de astrocitos y la migración se evalúa desde el borde del cubreobjetos.
Ambos ensayos han sido fundamentales en el estudio de los mecanismos subyacentes que implica la exclusión celular y la formación de frontera. Algunas de las moléculas identificadas mediante estas técnicas, como las N-cadherinas 15, condroitina sulfato proteoglicanos (CSPGs) 16,17, FGF / Heparina 18, Efe / Efrinas 19.
En este artículo se pretende describir ensayo límite y ensayo de migración en forma gradual y aclarar los posibles problemas técnicos que pudieran ocurrir.
Protocolo
1. Límite del ensayo:
- Preparación básica: la cámara de diapositivas están recubiertas con poli-D-lisina portaobjetos de vidrio durante la noche y estériles se preparan antes de comenzar el experimento. Medio se prepara con Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM), suplementado con 10% de suero fetal bovino (FCS), y el 1% penicilina-estreptomicina-Fungizon (PSF). También una botella de libre Calcio / Magnesio solución salina balanceada de Hanks (HBSS) se prepara.
- Primaria las células de Schwann de rata en cultivo en frasco se trypsinized durante 3 minutos con 0,1% de tripsina. Cultivos primarios de astrocitos de rata se trypsinized durante 5 minutos....
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Discusión
Los ensayos descritos anteriormente se han utilizado en diversos estudios que demuestran el papel de los múltiples factores que intervienen en la formación de frontera entre los Schwann, astrocitos y células de Schwann migración limitada en el entorno de los astrocitos.
Comprensión de los mecanismos que subyacen a estos eventos es fundamental, ya que permitiría el desarrollo de estrategias para optimizar y mejorar la integración de los injertos de células de Schwann después del trasplante y,.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Philippa Warren por su amable ayuda.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 41966-029 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170-088 | |
| FCS | Invitrogen | 10091-148 | |
| PSF | Invitrogen | 15240-062 | |
| BPE | Invitrogen | 13028-014 | |
| Forskolina | Calbiochem | 344273 | |
| Cubreobjetos | VWR international | 631-0149 | |
| Cubreobjetos (rectangulares) | Menzel-Glaser | BB022050A1 | |
| Placas con cámaras | Nalge Nunc international | 177380 | |
| Placas de 4 pozos, placas de 6 pozos | Nalge Nunc international | Placas de 4 pozosPlacas de 6 pozos | |
| Anticuerpo contra p75 de rata | EMD Millipore | MAB365 | |
| Anticuerpo contra GFAP | Dako | Z0334 | |
| Anticuerpos secundarios (conjugados con Alexa) | Invitrogen | A-11004 A-11034 | Anticabra anti ratón 568Anticabre anti conejo 488 |
| Secundario biotinilado | Vector Laboratories | Anticabre anti ratón | |
| Tabletas de DAB | Sigma-Aldrich | D4418 | |
| Kit ABC elite | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| Pinzas finas | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | P6168 | |
| Fluorosave | Calbiochem | 345789 |
Referencias
- Assouline, J. G. Rat astrocytes and Schwann cells in culture synthesize nerve growth factor-like neurite-promoting factors. Brain Res. 428, 103-118 (1987).
- Taylor, J. S., Bampton, E. T. Factors secreted by Schwann cells stimul....
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Reimpresiones y permisos
