Summary
대부분의 감염은 강력한 CTL 반응을 이끌어내는,하지만 가끔 응답 세포의 수량은 병원균 제어 상관 관계를하지 않습니다
Abstract
Carboxyfluorescein 디아 세 테이트 succinimidyl 에스테르 (CFSE)를 쉽고 빠르게 생체내 수사에 대한 관심의 세포 인구를 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 이 라벨은 고전적인 증식 및 마이 그 레이션을 공부하기 위해 사용되었습니다. 여기서 제시하는 방법, 우리는 에피토프 특정 CFSE 표시 대상 세포 4-6의 생존과 살인 볼 입양 전송 후 일정을 단축했습니다. 그들의 수량이 오해 할 수 있으므로 CD8 + T 세포 클론의 특정 살인의 수준은 응답의 품질을 나타낼 수 있습니다. CD8 + T 특정 세포가 시토킨 생산 및 살인 7,8의 감소와 함께 시간이 지남에 따라 기능 소진 될 수 있습니다. 또한, 특정 CD8 + T 세포 클론은 TCR의 specificities 9 각기 다른뿐만 아니라 다른 사람으로 죽일 수 없습니다. 효과적인 세포 매개 내성 (CMI)의 경우, 항원은 T 세포 응답의 충분한 숫자뿐만 아니라 생산 파악뿐만 아니라, 강력한 기능 responding T 세포를해야합니다. 여기 BALB / C 마우스의 두 펩타이드 구체적인 T 세포 클론의 비율 세포 구체적인 살인을 평가합니다.
Protocol
1. 예방 접종의 대상 - 특정 효과기 CTLs을 도출하는 것은 (주 0)
- 대상 시스템 : 시작하기 전에, 특정 이펙터에 따라 결정합니다. 생체내 CTL 분석의 고전이 예제에서, 우리는 특정한 CD8 + T 세포를 이끌어내는 수있는 정화 펩타이드 예방 접종을 사용합니다. 대상 시스템 : 동일한 펩타이드는 특정 이펙터를 작성, syngeneic 대상 세포를 펄스하는 데 사용됩니다. 또는 특정 effectors와 목표를 얻기 위해 전체 병원균이나 단백질을 사용하도록 선택할 수 있습니다.
- 주사의 불임을 보장하기 위해 biosafety 후드의 작업 표면 안으로 오염을 제거하다. 먼저 두 ML 튜브에 포함된 PBS / 마우스 100 μL의 10 % DMSO에 펩타이드를 정화 50 μg을 배치하여 펩타이드 예방 접종을 준비합니다. 다음 혼합을 위해 1mm 구슬로 최대 0.2 ML 마크 매우 추운 불완전 프로 인드의 도움이되는의 동일한 금액을 추가합니다. 이 시점에서 사출까지 얼음에 immunogen 보관하십시오. Parafilm과 보안 덮개.
- 즉시 혼합 후 얼음 다시 감광 유제를 삽입, 3 분 동안 감광 유제를 섞어 최대 RPM을 설정 구슬 때리는을 사용합니다. 결과 유제 일관성에 마요네즈와 유사해야합니다. 유제 4에 앉아 ° C 밤새 어떤 분리가 명시된 경우에는 시간이 허용하는가 (최대 주), 더 혼합하는 경우. 허용
- 모든 구슬을 끌어하지 않도록주의하고 유제를 잡아 1 ML의 주사기와 20 게이지 바늘 20.5을 사용하여 (구슬이 바늘의 측정보다 클 수 있지만, 여전히 인식해야합니다.)
- 꼬리의 기지에 피하 주입을위한 보안 마우스. 우리는 안전에 대한 수정 플라스틱 50 ML 원뿔 관을 사용하여 부드럽게 주사 마우스를 고정. 유제의 0.2 ML로 마우스를 주사.
2. 수확 대상 셀 (주 8)
- 당신은 목표 세포에 대한 순진한 syngeneic 마우스가 필요합니다. AAALAC 기준에 따라 순진한 쥐를 안락사.
- 마우스 머리 또는 기타 외부 오염 물질로부터 오염의 가능성을 최소화하기 위해 70 % 에탄올을 분사하여 마우스를 소독.
- 해부 가위를 사용하면 마우스의 왼쪽에있는 피부를 통해 작은 싹둑합니다. 복막 색과 내장을 밝히기 위해서 피부 플랩을 세워.
- 복막을 통해 싹둑, 조심되는 근본적인 기관 중 하나를 타협하지 않습니다. 비장은 표면에 가까이 있으며 컬러 간 (어두운 빨강)과 비슷하지만 작고 모양이 더 신장 콩입니다. 감염된 마우스는 일반적으로 감염되지 않은 컨트롤보다 특히 큰 spleens을 보여줍니다.
- 조심스럽게있는만큼 최대 휴대폰 번호를 복구하기 위해서는 여러 조각으로 비장을 깰하지 부드럽게하는 간병, 비장을 당겨. 즉시 얼음 준비 매체 10 MLS를 포함한 15 ML 원뿔로 비장을 놓으십시오. 나머지 생쥐를 계속합니다.
- 유리 조직 분쇄기로 15 ML 원뿔 튜브 (미디어 및 비장)의 내용을 하거라. 팔 위쪽 강도 많이 사용하여 비장을 분쇄. 모든 조직은 그것의 색깔을 잃었되면 당신은 결합 조직 밖으로 모든 세포를 회수했다고 가정 수 있습니다.
- 50 ML 원뿔 관에 70 μm의 셀 필터를 통해 분쇄기의 내용을 하거라. 신선한 매체와 그라인더를 씻어 셀 스트레이너를 통해 부어.
- 4 원심 분리기 ° C, 7 분 동안 1,300 RPM. 뜨는을 하거라.
- 7분을 위해 37 °에서 준비 lysing 시약 및 부화 10 MLS에 Resuspend.
- 신선한 미디어와 원심 분리기, 상기와 같은과 50 MLS 개까지 추가할 수 있습니다.
- 50 MLS 신선한 미디어 및 원심 분리기 (세척 단계) 위와 같은에서 Resuspend. * 참고 : 순수한 대상 셀 인구가받는 마우스로 전송 원하는 경우이 시점에서 당신은 특정 세포 유형에 대한 자기 세포 분리 (예 : macrophages)를 수행할 수 있습니다. 또한이 시간에 당신은 특정 세포 죽이는 그 치료의 영향을 연구하기 위해 문화에 실험적 치료를 소개 수 있습니다.
- 96 잘 라운드 바텀 조직 문화 처리 플레이트에 100μL의 X 10 7 잘 따라 세포 및 플레이트 1 카운트. *이 세포 / 음의 높은 농도이지만, 분석이 간단하기 때문에, 우리가이 농도에서 세포의 생존에 손실을 본 적이있다.
3. 대상 세포 치료 및 라벨링
- 펄스 적절한 세포와 병원체 특정 펩타이드 또는 펩타이드없는 컨트롤과 함께 복제 : 1 μg / ML 펩타이드를 추가합니다. 1.5 시간 4 ° C에서 알을 품다. 지난 30 분 동안 37 ° C 배양기로 이동합니다. 이 시간 동안 CFSE 시약을 준비합니다.
- 제조 업체 사양에 따라 CFSE을 준비하고 0.5 및 25 μm의 사이에서 작동하는 농도로 희석. "높음"농도 CFSE보다 낮은 '낮음'농도가 10X합니다. 예를 들어, [낮은] 10 MLS PBS에 0.5 μL CFSE를 추가하고 위해 [고급] 10 MLS PBS로 5 μL CFSE를 추가합니다. 37 따뜻한 준비 CFSE ° C 레이블링하기 전에.
- 인큐베이터와 P에서 세포의 플레이트를 제거합니다실온, 7 분 동안 1,300 rpm으로 고속 원심 분리기에 ellet. 뜨는 제거 플릭.
- [낮은] 또는 해당 우물 적절한 시약 200 μL를 추가하고 37 15 분 동안 품어 °에서 [고급] CFSE C. 어느 Resuspend 세포
- 실온, 7 분 동안 1,300 rpm으로 보육하고 다시 펠릿 세포 플레이트를 제거합니다. 뜨는 제거 플릭.
- 37 200 μL / 잘 예열 신선한 매체와 30 분 동안 품어의 Resuspend 세포 ° C.
- 실온, 7 분 동안 1,300 rpm으로 보육 및 펠릿 세포 플레이트를 제거합니다. 뜨는 제거 플릭.
- 100 μL / 잘 PBS에 Resuspend 세포.
- 입양 전송을위한 하나 추가 물론 [낮은] 한 레이블 셀 잘 [고등] 마우스 세포마다 표시. 주사를 발생하는 0.2 MLS에 50% 구체적인 목표 50 % 관련이없는 세포가되어야합니다.
- (그림 1 참조) 데이터 분석 도중 흐름 cytometer에서 실행에 대한 비 - 전송 제어의 역할을 몇 가지로 분류 세포를 별도로 설정하는 것을 잊지 마십시오.
4. 입양 전송
- AAALAC 기준에 따라 이전 펩타이드 예방 접종을 쥐 (이 프로토콜의 일부로 # 1에서) 마취.
- 받는 마우스로 역 궤도 경로를 통해 표시 대상 세포의 0.2 MLS를 주사.
- 받는 사람 쥐를 euthanizing 6 시간 전의 또는 기타 미리 결정된 최적의 시간을 기다리십시오.
5. 수확 라벨 셀
* 참고 : 5.11 통해 5.1 2.11 통해 2.1 단계와 동일합니다 단계
- 96 자 라운드 바텀 조직 문화 처리 플레이트에 100 μL의 X 10 6 자 당 1 셀 및 플레이트 아웃 카운트.
- 모든 우물을 1 % paraformaldehyde의 최종 농도 100 μL 2 % paraformaldehyde를 추가하여 회수 및 비 전송 세포를 수정.
6. 유동세포계측법 및 데이터 분석
- 흐름 cytometer에 샘플을 실행하고 데이터를 분석할 수 있습니다.
7. 대표 결과
결과 히스토그램에 떨어지 에피토프 특정 피크가 특정 세포 죽이는 (그림 1)의 지표이다. 특정 세포 용해의 실제 가치를 결정하기 위해 다음과 같은 방정식을 (표 1 적용)를 사용 :
비율 = 관련성이 비율 : 에피토프 특정 비율 ([낮은] 최대 : [고등] 피크),
퍼센트 특정 용해 = [1 - (비 전송 제어 비율 / 실험 비율)] X 100
그림 1. BALB / C 마우스 splenocytes를 발견 했어요. 숫자 CFSE 프로필은 높거나 낮은 CFSE의 표현형의 세포의 비율을 나타냅니다. A) 컨트롤을 비 - 양도. [낮은] CFSE의 봉우리가없는 펩타이드와 펄스 목표를 대표하는 동안 모든 [고급] CFSE의 봉우리는 에피토프 특정 타겟 세포를 나타냅니다. B) CFSE 라벨이 세포는 PBS 예방 접종을받는 마우스 (컨트롤)에서 복구. C) 두 개의 다른 펩타이드 특정받는 마우스에서 발견한 CFSE 라벨 세포는 감소 에피토프 특정 봉우리를 적어 둡니다.
그림 2. 분석 데이터의 그래픽 표현. 쓰리 데이터 요소는 마우스의 각 그룹, PBS, 펩타이드 및 펩타이드 B.에 대한 표시
| 견본 | CFSE HIGH %의 에피토프는 펄스 | 엉뚱 CFSE LOW % | 비율 낮음 : 높음 | 퍼센트 에피토프 특정 죽이는 |
| PBS | 42.8 | 57.2 | 1.34 | 16.97 |
| PBS | 43.1 | 56.9 | 1.32 | 15.94 |
| PBS | 44.3 | 55.7 | 1.26 | 11.74 |
| 펩타이드 | 39.7 | 60.3 | 1.52 | 32.56 |
| 펩타이드 | 38.6 | 61.4 | 1.59 | 35.61 |
| 펩타이드 | 40.6 | 59.4 | 1.46 | 29.99 |
| 펩타이드 B | 38.7 | 61.3 | 1.58 | 24.68 |
| 펩타이드 B | 38.5 | 61.5 | 1.60 | 25.32 |
| 펩타이드 B | 39.3 | 60.7 | 1.54 | 22.76 |
| PBS NT 제어 | 47.4 | 52.6 1.11 | ||
| 응원 NT 제어 | 49.4 | 50.6 | 1.02 | |
| 펩 B NT 제어 | 45.6 | 54.4 | 1.19 |
표 1. 대표 데이터의 분석. "NT"는 아닌 전송됩니다.
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Discussion
CFSE가 자손 10,11 가운데 상대적으로 균등하게 분할하기 때문에 분석은 clonal 확장을 포함한 세포의 proliferative 용량을 조사하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 예제 tetramers 또한 CFSE 라벨과 함께있을 수 있습니다 bioluminescence 13, 귀하의 가정에 따라 더 적절한 수 방법을 추적 기타 조직이있다하지만, 휴대 마이 그 레이션 6,12를 조사하기 위해 CFSE 라벨을 사용하는 것도 가능합니다.
PE뿐 아니라 작동하지 않을 수 있습니다 동안 표면 마커에 대한 공동 얼룩 싶으면 너무, 흐름 cytometer에 여러 채널로를 통해 해당 CFSE의 스며들에 유의하는 것이 중요합니다, PeCy7는 형광단의 좋은 선택이 될 것입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다. 동물 실험은 위스콘신 - 매디슨 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)에서 정한 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
나는 면역 assays 및 마우스 처리 나를 소개하는 비앙카 Mothé, 칼라 Oseroff 및 마리 - 프랑스 DelGuercio 감사하고 싶습니다. GA 분배기의 연구실에서 작업이 NIH 그랜트 1 RO1 - AI - 073558, GLRCE 부여 1 - U54 - AI - 057153 및 바드 미국 3829-06에 의해 후원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 96-well plate | Costar | 3799 | |
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, by Life Technologies | 16000-077 | |
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter Inc. | n/a | |
| Kontes glass tissue grinder | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | |
| Needle | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | 10010-023 | |
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
References
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
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