Summary
Il modello murino di
Abstract
Il trapianto di cellule staminali in utero e virus ha un potenziale enorme per il trattamento di malattie congenite nel feto umano. Per esempio, nel trapianto di utero (IUT) di cellule staminali ematopoietiche è stato usato per trattare con successo pazienti con grave immunodeficienza combinata 1,2. In altre condizioni, tuttavia, IUT è stata tentata senza successo. 3 Alla luce di questi risultati contrastanti, la disponibilità di un efficiente non umani modello per studiare le conseguenze biologiche del trapianto di cellule staminali e la terapia genica è fondamentale per far avanzare questo campo. Noi e altri ricercatori hanno utilizzato il modello murino di IUT di studiare fattori che influenzano il successo di attecchimento in utero trapiantato cellule staminali ematopoietiche in entrambi i topi wild-type 4-7 e quelli con malattie genetiche. 8,9 L'ambiente fetale offre anche notevoli vantaggi per l' successo della terapia genica in utero. Per esempio, la consegna di adenovirali 10, virale adeno-associato 10, retrovirali 11 e vettori lentivirali 12,13 nel feto ha portato alla trasduzione degli organi più distanti dal sito di iniezione a lungo termine l'espressione genica. Nell'utero La terapia genica può quindi essere considerato come una possibile strategia di trattamento per i disturbi del singolo gene come la distrofia muscolare o la fibrosi cistica. Un altro potenziale vantaggio del IUT è la capacità di indurre tolleranza immunitaria ad un antigene specifico. Come si è visto nei topi affetti da emofilia, l'introduzione del fattore IX presto risultati di sviluppo della tolleranza a questa proteina 14.
In aggiunta al suo utilizzo nelle indagini potenziali terapie umane, il modello murino di IUT può essere un potente strumento di riflessione su questioni di base in biologia cellulare e dello sviluppo staminali. Per esempio, si possono fornire diverse piccole molecole di indurre o di inibire l'espressione del gene specifico a definire le fasi di gestazione e manipolare i percorsi di sviluppo. L'impatto di queste alterazioni possono essere valutate in punti temporali diversi dopo il trapianto iniziale. Inoltre, si possono trapiantare pluripotenti o lignaggio cellule progenitrici specifici nell'ambiente fetale per studiare la differenziazione delle cellule staminali in un ambiente host non irradiato e imperturbabile.
Il modello murino di IUT ha già fornito numerose intuizioni nei settori di immunologia e biologia cellulare e dello sviluppo staminali. In questo video basato su protocollo, si descrive passo-passo approccio a svolgere IUT in feti di topo e indicare le tappe critiche e potenziali insidie di questa tecnica.
Protocol
1. Preparazione del Pipette iniezione
- Calibrare l'estrattore pipetta in modo tale che la separazione della pipetta di vetro avviene entro 15 secondi (vedere le istruzioni del produttore per quanto riguarda la taratura). La pipetta avrà un cono in cui separa.
- Tagliare l'estremità della pipetta in modo che la distanza dall'inizio del cono fino alla fine della pipetta è 1,04 centimetri a 1,05 centimetri. La lunghezza della pipetta è inversamente proporzionale al calibro dell'orifizio pipetta. Essere consapevoli del fatto che per fare una pipetta di più provoca anche una punta più debole che è più suscettibile alle rotture durante l'iniezione.
- Il prossimo passo per rendere la pipetta è quello di creare uno smusso liscia da affilare la punta di diamante su una ruota affilatura. Al momento del taglio della pipetta alla dimensione del caso, la pipetta rompe spesso con uno smusso naturale sulla punta che deve essere usata quando si inserisce la pipetta sulla ruota. Durante questo processo, è importante riposare delicatamente la pipetta sulla ruota affilatura e rivalutare periodicamente per assicurarsi che la pipetta è ancora in contatto con la ruota (come la smussatura diventa più liscia, perderà il contatto con la ruota sharpening).
- Una volta che la coppia conica è liscia, la punta della pipetta deve essere affilato (Figura 1). Elevare la pipetta in modo tale che non è più toccando la ruota affilatura, ruotare in senso orario con 10-50 gradi, e posto sul retro pipetta sulla ruota girevole affilatura per ~ 10 secondi. Ritirare la pipetta dalla ruota affilatura e ora esaminare il bordo. Questa fase di solito deve essere ripetuto con diversi piccoli aggiustamenti per creare un bordo tagliente. Se la pipetta è posizionato sul bordo per troppo tempo, è più probabilità di sviluppare una superficie irregolare (Figura 1). Dopo aver completato un lato, si può procedere per affinare il bordo opposto ripetendo i passaggi precedenti.
- Utilizzare un pennarello indelebile per disegnare una linea circonferenziale ogni quattro millimetri di partenza dove il cono della pipetta comincia. Tale delimitazione corrisponde a 5UL di volume.
2. Nell'utero trapianto
- Dopo aver preparato il materiale iniettabili (per esempio le cellule, virus, ecc) è possibile impostare per l'iniezione. Usiamo un microinjector collegato ad aria compressa con le seguenti impostazioni: (impostazioni di pressione: ingresso 60-80 psi, riempire 40 psi, iniettare 8-12 psi, equilibrio 0 psi, tenere premuto 0 psi, il tempo di iniezione 100 millisecondi).
- Per sterilizzare la pipetta di iniezione, pulire due volte con EtOH 70% seguita da due volte con PBS 1X sterile. Come la punta della pipetta è molto fragile, si sconsiglia di sterilizzazione in autoclave le pipette di iniezione.
- Le iniezioni possono essere fatto usando 2.5X-3.5X occhialini ingrandimento o un microscopio da dissezione. Preparare l'area di procedura con una coperta il riscaldamento, l'illuminazione e gli strumenti chirurgici necessari.
- Anestetizzare il mouse in stato di gravidanza (che utilizziamo isofluorano e ossigeno forniti tramite una unità di anestesia continua di flusso). Posizionare il mouse su una piastra elettrica in posizione supina e apporre ogni arto con del nastro adesivo per fissare il mouse in posizione.
- Agganciare il pelo. Poi, indossando guanti chirurgici sterili, preparazione l'addome con 10% di povidone-iodio seguito da alcol, e iniettare un analgesico come la buprenorfina.
- Eseguire un'incisione 1 centimetro nel basso addome (l'aspetto più inferiore della incisione dovrebbe essere di circa 1 centimetro superiore alla introitus). Incidere la pelle e la fascia. Fare attenzione a non danneggiare gli organi addominali (intestino e vescica), che sono immediatamente sotto lo strato sottile di fascia.
- Utilizzando tamponi di cotone, delicatamente allungare la fascia e fornire l'utero gravido attraverso l'incisione. Contare il numero totale di feti per prima cosa identificare le ovaie a destra ea sinistra per essere sicuri di visualizzare l'intero utero. Posto l'utero indietro nella cavità addominale prima di procedere in modo che i feti restano caldo mentre si prepara per le iniezioni.
- Aspirare il volume appropriato di materiale per il numero di feti si prevede di iniettare. Mentre si riempie l'ago con il campione, è importante mantenere la punta della pipetta sommersa per evitare aspirare il campione nel tubo microinjector. Dato che le cellule sono generalmente in un piccolo volume, di solito loro posto in una microcentrifuga di piccole dimensioni (es: 0,5 ml), tubo o direttamente su un pezzo di Parafilm essere in grado di riempire l'ago senza rompere la punta della pipetta.
- Premere delicatamente ogni feto e identificare la parte del feto si prevede di iniettare (ad esempio il fegato, cavità peritoneale, gamba, ecc.) Con il pollice e l'indice, è necessario stabilizzare il feto nella cavità amniotica in modo che non ruoti mentre si sta eseguendo l'iniezione. E 'importante tenere il feto con fermezza sufficiente a stabilizzarlo ancora abbastanza delicatamente per evitare di danneggiarlo.
- Inserire con cautela la pipetta attraverso l'utero, amnios, e la pelle del feto, e in l'organo bersaglio. Se la pipetta è tagliente, dovrebbe passare facilmente attraverso questi tessuti. Se la punta della pipetta è noiosa, è wi ll tenting avviso di dell'utero e delle membrane amniotiche. Iniettare il volume desiderato in ogni feto. E 'imperativo che i vostri movimenti essere costante durante il periodo di inserimento, l'iniezione, e il ritiro della pipetta.
- Una volta che il volume desiderato viene iniettato, ritirare la pipetta con attenzione. Se fatto correttamente, materiale non deve fuoriuscire dalla cavità amniotica o dell'utero. Se un grande buco viene creato nel sacco amniotico, che si può riconoscere dalla fuoriuscita di liquido amniotico, poi la sopravvivenza è messa a repentaglio. Infine, per gli studi che prevedono la raccolta post-natale, tutti i feti devono ricevere iniezioni tecnicamente perfetto in quanto non c'è modo di distinguere i feti iniettato e uninjected dopo la nascita.
- Se si esegue iniezioni nel fegato fetale, si può occasionalmente vede del sangue nella punta della pipetta, dopo il ritiro, questo conferma che sono nella posizione corretta e non dovrebbe pregiudicare la sopravvivenza. Se si esegue iniezioni intra-peritoneale, hanno lo scopo leggermente al di sotto del fegato fetale. Per le iniezioni intramuscolari, è possibile posizionare il feto per identificare l'anca e femore e iniettare il muscolo gluteo. Infine, per preparazioni iniettabili intraventricolare, è facile vedere i punti di sutura coronale per dirigere la pipetta al bersaglio appropriato. Per queste iniezioni, pipette calibro leggermente più grandi sono necessari per penetrare il cranio senza rompere la pipetta.
- Successivamente, con cura posto l'utero indietro nella cavità addominale. Assicurarsi che non sia attorcigliata su se stessa o attorno al suo apporto vascolare. Consegna 1 ml di PBS 1X sterile nella cavità peritoneale della madre per sostituire qualsiasi fluido che è stato perso durante la procedura. Chiudere l'incisione a 2 strati con una sutura assorbibile intrecciata 5-0 (es: Vicryl). Prima chiudere la fascia senza ferire l'intestino o vescica sottostante, e quindi chiudere la pelle.
- A questo punto, dopo la procedura di farmaci possono essere somministrati per l'analgesia. Ritorno ogni femmina iniettato nella sua gabbia individuale e posizionare la gabbia in una coperta riscaldamento. Monitorare il mouse fino a quando non è in posizione verticale. Mettere biancheria da letto nella gabbia e posizionare il mouse in una zona tranquilla della struttura del mouse dove non dovrebbe essere disturbato (cioè non la pulizia della gabbia) fino a diversi giorni dopo il parto. Riducendo al minimo qualsiasi ulteriore stress per l'animale si riduce la probabilità di parto pretermine.
- Una volta completato l'iniezione, pulire la pipetta sterile due volte con PBS 1X ed una volta con il 70% EtOH.
- Femmine iniettare deve essere osservato ogni giorno per assicurare che si stanno riprendendo dalla procedura senza difficoltà. L'incisione devono essere monitorati per gonfiore, infiammazione segni, la separazione delle ferite, e altre infezioni. Post-operatorio analgesici possono essere somministrati, se necessario.
3. Rappresentante dei risultati:
La sopravvivenza dei feti iniettato a termine la consegna è il principale fattore limitante per raggiungere il successo con questa tecnica. A seconda del materiale iniettato e la tensione di mouse utilizzato, i tassi di sopravvivenza può variare. In generale, le iniezioni di cellule ematopoietiche in topi wild-type a E14 dovrebbe tradursi in almeno il 50% nati vivi cuccioli. Alti tassi di sopravvivenza sono possibili a seconda sia gli aspetti tecnici della iniezione e le caratteristiche dei topi viene iniettato.
Ridurre al minimo il trauma per le membrane dell'utero e amniotico è l'aspetto più importante tecnica di questo protocollo. Sharp, pipette di piccolo calibro si tradurrà in minimo trauma uterina durante l'iniezione. Si consiglia di non utilizzare aghi da iniezione standard del calibro di prefabbricati aghi è troppo grande e si tradurrebbe in un grande buco in utero. Fatti a mano pipette iniezione di vetro sono gli unici aghi di piccolo calibro che possono essere utilizzati per iniezioni in utero. Un'attenta e meticolosa tecnica chirurgica, compresa la gestione delicata dell'utero e una breve anestesia è fondamentale anche per ottenere risultati ottimali.
Caratteristiche specifiche dei topi riceventi come il background genetico, l'età gestazionale, e la dimensione cucciolata può colpire anche la sopravvivenza. Alcuni ceppi di topi sono più suscettibili di parto pretermine e la perdita di gravidanza, a seconda del loro background genetico. 15 animali transgenici con difetti muscolari o neurodegenerative può avere una ridotta capacità di offrire feti vaginale dopo aver subito una laparotomia mediana. 8 Queste donne in gravidanza può richiedere la consegna da parte taglio cesareo. Abbiamo anche scoperto che l'età gestazionale al momento della iniezione può impatto vitalità. Feti che sono di età inferiore ai 12 giorni embrionali hanno una minore incidenza di sopravvivenza rispetto ai vecchi feti. Infine, abbiamo trovato che le dimensioni dei rifiuti di grandi dimensioni (> 10 feti) tendono ad avere più alti tassi di morte del feto dopo l'iniezione. Attenzione sia gli aspetti tecnici di questa tecnica e le caratteristiche specifiche dei topi essere iniettato in grado di massimizzare la sopravvivenza dei feti iniettato.
ve_content "> Quando questi metodi vengono eseguite correttamente, ci si può aspettare che tutti i feti sono esposti al materiale iniettato. Simile l'impostazione post-natale, tuttavia, la consegna di successo di cellule o virus in utero non sempre risultato attecchimento delle cellule del donatore o gene espressione, rispettivamente. attecchimento delle cellule staminali, per esempio, dipende da diversi fattori quali la dose e la fonte delle cellule trapiantate. Allo stesso modo, il successo di trasduzione virale è, in parte, determinata dal tipo di vettore virale usato. Si deve capire i numerosi fattori che la sopravvivenza impatto cucciolo, attecchimento cellulare e trasduzione virale per raggiungere il successo con questo protocollo.
Figura 1. Diagramma raffigurante corretta affilatura delle pipette di iniezione (Punto 1.4)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oltre 50 anni fa, Billingham, Brent e Medawar utilizzati in utero trapianto nei topi per indurre tolleranza immunitaria a proteine estranee. 16 Da allora, diverse varianti di questa tecnica sono stati utilizzati per affrontare le questioni in immunologia e la biologia delle cellule staminali.
Il protocollo dettagliato qui è uno dei metodi più accessibile per IUT. Il fegato fetale propone un obiettivo facilmente visualizzati e fornisce l'accesso alla circolazione sistemica attraverso il portale e le vene epatiche. Tuttavia, alcune modifiche sono state descritte in modo da ottimizzare i tempi e il luogo di iniezione desiderato. Per esempio, le iniezioni nei feti di età inferiore ai E13.5 può essere più difficile, perché l'utero non è trasparente. Se questo approccio è necessario studiare eventi precedenti nello sviluppo, controllo ecografico iniezioni possono essere utilizzati per indirizzare particolari tessuti. 17 guida ecografia è utile anche per l'iniezione diretta in organi particolari, come il cuore oi polmoni. Iniezioni endovenose in vena vitellina 18,19 offrono il vantaggio di fornire cellule direttamente in circolo e può consentire la consegna di volumi di cellule. 5 Abbiamo volutamente descritto un approccio generale a svolgere IUT nei topi in modo che il lettore ha la fondamento necessario per raggiungere il successo con queste iniezioni e in grado di adattare questi metodi per l'applicazione specifica richiesta.
Nonostante il suo utilizzo iniziale di studio di tolleranza immunitaria oltre 50 anni fa, ci sono ancora domande senza risposta importante per il quale IUT sarà istruttivo. La capacità di indurre tolleranza a specifici antigeni estranei dal loro introduzione nell'ambiente fetale è stato dimostrato nei topi. 4,6,7 Mentre fetale sistema immunitario del mouse si sviluppa più tardi di quella di animali più grandi e possono influenzare questo risultato, i precisi meccanismi di che la tolleranza del feto si verifica nei topi bisogno di essere ulteriormente studiati. Tali esperimenti possono chiarire modi per migliorare l'induzione della tolleranza negli esseri umani. Anche nei topi, fattori quali la disponibilità di nicchie ematopoietiche e il vantaggio competitivo delle cellule ospiti continuano a limitare il successo di attecchimento delle cellule staminali. 3 strategie attuali di approfondire questo includono la manipolazione di specifici meccanismi della risposta immunitaria e ottimizzando il percorso, tempi, e la dose di consegna delle cellule staminali. IUT nel topo gestazione fornisce un modello ideale per studiare l'attecchimento delle cellule staminali e la differenziazione.
IUT è un potente strumento per comprendere le questioni fondamentali in materia di cellule staminali e biologia dello sviluppo. Definire i meccanismi che portano alla tolleranza agli antigeni fetali introdotto in utero avrà importanti implicazioni per il settore del trapianto di cellule staminali. Inoltre, la consegna di successo dei vettori virali possono fornire un trattamento per malattie monogeniche. La disponibilità di numerosi ceppi di topi transgenici e mutanti permette di indagine sul ruolo di specifici geni giocare per modificare il fenotipo atteso. Il modello murino di IUT senza dubbio la promozione di tali campi e avvicinarci a realizzare il loro pieno potenziale clinico per il trattamento di pazienti affetti da anomalie congenite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo riconoscere le nostre fonti di finanziamento: Il California Institute for Training rigenerativa di Grant Fellow Medicina Clinica (AN), National Science Foundation (MW), Irene Premio Perstein (TCM), American College of Surgeons (TCM), American Pediatric Surgical Association ( TCM), e il March of Dimes (TCM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipettes | Kimble Chase | 71900-100 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-30 | |
| Microinjector | Narishige International | IM-300 | |
| Pipette sharpener | Sutter Instrument Co. | Model BV-10 |
References
- Flake, A. W. Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow. N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).
- Wengler, G. S. In-utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDXI). Lancet. 348, 1484-1487 (1996).
- Flake, A. W., Zanjani, E. D. in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers. Blood. 94, 2179-2191 (1999).
- Merianos, D. J. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119, 2590-2600 (2009).
- Peranteau, W. H., Endo, M., Adibe, O. O., Flake, A. W. Evidence for an immune barrier after in utero hematopoietic-cell transplantation. Blood. 109, 1331-1333 (2007).
- Kim, H. B., Shaaban, A. F., Yang, E. Y., Liechty, K. W., Flake, A. W. Microchimerism and tolerance after in utero bone marrow transplantation in mice. J Surg Res. 77, 1-5 (1998).
- Durkin, E. T., Jones, K. A., Rajesh, D., Shaaban, A. F. Early chimerism threshold predicts sustained engraftment and NK-cell tolerance in prenatal allogeneic chimeras. Blood. 112, 5245-5253 (2008).
- Mackenzie, T. C., Shaaban, A. F., Radu, A., Flake, A. W. Engraftment of bone marrow and fetal liver cells after in utero transplantation in MDX mice. J Pediatr Surg. 37, 1058-1064 (2002).
- Hayashi, S. Mixed chimerism following in utero hematopoietic stem cell transplantation in murine models of hemoglobinopathy. Exp Hematol. 31, 176-184 (2003).
- Bouchard, S. Long-term transgene expression in cardiac and skeletal muscle following fetal administration of adenoviral or adeno-associated viral vectors in mice. J Gene Med. 5, 941-950 (2003).
- Meza, N. W. Rescue of pyruvate kinase deficiency in mice by gene therapy using the human isoenzyme. Mol Ther. 17, 2000-2009 (2009).
- MacKenzie, T. C. Efficient transduction of liver and muscle after in utero injection of lentiviral vectors with different pseudotypes. Mol Ther. 6, 349-358 (2002).
- MacKenzie, T. C. Transduction of satellite cells after prenatal intramuscular administration of lentiviral vectors. J Gene Med. 7, 50-58 (2005).
- Sabatino, D. E. Persistent expression of hF.IX After tolerance induction by in utero or neonatal administration of AAV-1-F.IX in hemophilia B mice. Mol Ther. 15, 1677-1685 (2007).
- Mellor, A. L., Munn, D. H. Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression. Annu Rev Immunol. 18, 367-391 (2000).
- Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172, 603-606 (1953).
- Endo, M. Gene transfer to ocular stem cells by early gestational intraamniotic injection of lentiviral vector. Mol Ther. 15, 579-587 (2007).
- Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
- Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer. Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).
