Combinaison de adhésif à base de bandes d'échantillonnage et de fluorescence In situ pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

Summary

Ce protocole décrit un simple adhésif à base de bandes approche pour l'échantillonnage de tomate et d'autres surfaces de produits frais, suivie d'une détection rapide des cellules de l'ensemble du

Abstract

Ce protocole décrit une méthode simple pour les adhésifs à base de bandes d'échantillonnage de tomate et d'autres surfaces de produits frais, suivi par le bande hybridation fluorescente in situ (FISH) pour rapidement indépendante de la culture de détection de Salmonella spp. Cell-bandes chargées peuvent également être placées face cachée sur une gélose sélective pour l'enrichissement en phase solide avant la détection. Alternativement, les enrichissements de liquide de faible volume (miniculture surface du liquide) peut être effectuée sur la surface de la bande dans un bouillon non sélectif, suivis par les poissons et l'analyse par cytométrie en flux. Pour commencer, ruban adhésif stérile est mis en contact avec des produits frais, une légère pression est appliquée, et la cassette est retirée, extraire physiquement les microbes présents sur ces surfaces. Les bandes sont montées collant vers le haut sur des lames de microscope en verre et les cellules prélevées sont fixés avec du formol à 10% (30 min) et déshydratés à l'aide d'une série d'éthanol à (50, 80 et 95%; 3 min de chaque concentration). Ensuite, la cellule chargée des bandes sont repérés avec le tampon contenant un cocktail de Salmonella ciblées sonde ADN et hybrides pour les 15 - 30 min à 55 ° C, suivi par un bref rinçage dans un tampon de lavage pour enlever la sonde non liée. Adhérents, FISH cellules marquées sont ensuite contre-colorées avec de l'ADN de teinture 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et les résultats sont considérés en utilisant la microscopie à fluorescence. Pour en phase solide enrichissement, la cellule chargée des bandes sont placées face cachée sur une surface de gélose sélective adaptés et mis en incubation pour permettre la croissance in situ des microcolonies Salmonella, suivis par les poissons et la microscopie comme décrit ci-dessus. Pour miniculture surface du liquide, la cellule chargée des bandes sont placées côté collant et une chambre de perfusion de silicone est appliqué de telle sorte que le ruban et la forme de la lame de microscope fond d'une chambre étanche dans laquelle un petit volume (≤ 500 pi) de trypticase soja Bouillon (BST) est introduit. Les ports d'entrée sont fermées et les chambres sont incubées à 35 - 37 ° C, permettant une croissance basée sur l'amplification de la bande-extrait de microbes. Après incubation, les ports d'entrée sont descellés, les cellules sont détachées et mélangées avec le dos vigoureuse-et-vient de pipetage, récolté par centrifugation et fixés dans 10% du formol tamponné neutre. Enfin, les échantillons sont hybridés et examiné par cytométrie en flux pour révéler la présence de Salmonella spp. Comme il est décrit ici, notre "bande-FISH» approche peut fournir d'échantillonnage simple et rapide et la détection de Salmonella sur des surfaces de tomates. Nous avons également utilisé cette approche pour l'échantillonnage d'autres types de produits frais, y compris les épinards et les piments jalapeño.

Protocol

1. L'échantillonnage de surface avec du ruban adhésif stérile

1. Sélectionnez une bande à utiliser pour l'échantillonnage. Le commerce des champignons-Tape ou Con-Tact-Il bandes d'échantillonnage sont stériles et spécialement conditionnés pour la facilité d'utilisation. Toutefois, nous avons constaté que la transparence (optiquement clair) de bandes de bureau génériques peuvent également être utilisés.
2. Utilisez un marqueur indélébile pour dessiner des carrés de 1 cm ² sur le côté non collant d'un morceau de 10 cm de ruban adhésif (un modèle de papier peuvent être utilisés). Cela servira de guide visuel pour noter quelle portion de la bande a été utilisée pour l'échantillon de la surface des aliments ou l'environnement.
3. Former un «C» en forme de boucle de ruban, avec le côté collant face à la surface à échantillonner. Pour ce faire, tenir les extrémités collantes avec le pouce et le majeur et l'index de position contre le carré dessiné sur le dos (non collante côté) de la bande (figure 1).
4. Placez le ruban sur la surface à échantillonner et appuyez doucement sur la zone marquée sur la surface. Sans relâcher les bords de la bande, utiliser l'index pour s'assurer que le côté collant de la bande vient en plein contact avec la surface de l'échantillon, en évitant les bulles.
5. Avec un mouvement même, tirez lentement le ruban loin de l'échantillon, à extraire physiquement liée à la surface des microbes. Fixez la bande de cellules chargées, côté collant en haut, sur une lame de microscope en verre à l'aide de bandes de bureau générique transparente. Assurer une bonne tension / étirement de la bande de sorte que d'un appartement, non ridée surface est créée. Cela aidera à minimiser les problèmes de déformation / curling de la bande pendant le chauffage subséquente au cours de l'hybridation.

2. En phase solide d'enrichissement et Miniculture surface liquide

1. Solid-phase d'enrichissement est réalisé en plaçant le ruban à plat ventre sur le xylose-lysine-Tergitol 4 (XLT-4) des plaques d'agar de sorte que les cellules prélevées sont mises en contact direct avec la surface de la gélose. La portion de contact basés sur des modèles / échantillon de la bande est placée au ras de la surface de la gélose et une extrémité de la bande est lâche adhéré à la paroi latérale de la boîte de Pétri pour faciliter le retrait facile de la bande de la surface de la gélose après enrichissement.
2. Les plaques sont inversés (pour éviter la condensation) et incubées à 35 - 37 ° C pour permettre une croissance suffisante de Salmonella spp. La longueur de la période d'incubation nécessaire pour enrichir les cellules à un niveau détectable dépendra niveaux initiaux de contamination par Salmonella. Nous avons observé la formation de microcolonies excellente inoculums initial faible après 8 h d'enrichissement.
3. Après la période d'enrichissement désiré, ouvrez la plaque de gélose. La bande conserve son adhésivité pendant l'incubation. Appuyez doucement sur le ruban contre la gélose en utilisant l'index pour assurer une récupération maximale de microcolonies formée à l'interface ruban-agar. Saisir la bande du bord attaché à la paroi de la boîte de Petri et de l'enlever avec une lenteur, même le mouvement. Montez la bande cellule chargée, côté collant en haut, sur une lame de microscope comme décrit dans la section 1.5 ci-dessus. Passez à «Fixation et déshydratation" étape ci-dessous.
4. Pour miniculture surface du liquide, commencez par la fixation de la bande utilisée pour l'échantillonnage sur une lame de microscope comme décrit dans la section 1.5 ci-dessus. Ensuite, couvrir la partie de contact basés sur des modèles / échantillon de la bande avec une chambre non stérile en silicone perfusion (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc), formant une enceinte hermétique dont le fond est composé de la bande de cellules chargées, vers le haut. Fermement, mais appuyez doucement sur la chambre en place pour assurer un joint étanche.
5. L'utilisation d'un gel souple de chargement pointe de la pipette, transférer ≤ 500 uL de bouillon trypticase-soja ou tout autre support approprié d'enrichissement par l'un des ports de la chambre petite crique. Joint deux ports avec du ruban adhésif transparent pour éviter de bureau diapositives évaporation et incuber à 35 -37 ° C selon les besoins d'enrichissement suffisant. Bien que toutes les opérations devraient être effectuées conformément aux bonnes pratiques d'échantillonnage et la manutention, la stérilité de Port-ruban d'étanchéité ou de chambres de perfusion n'est pas nécessaire lors de miniculture surface du liquide. La combinaison de la FISH et cytométrie en flux permettra une discrimination claire de Salmonella spp. à partir de bactéries non-cibles qui peuvent être présents, avec la plus grande contribution des non-cibles flore devrait provenir de l'échantillon lui-même. Passez à «Fixation et déshydratation" étape ci-dessous.

3. Fixation et déshydratation

1. Pour l'échantillonnage de surface directe ou pour l'enrichissement en phase solide de Salmonella spp. pour XLT-4 agar, effectuer la fixation des cellules sur cassette pendant 30 min à 25 ° C en couvrant la surface de contact de l'échantillon avec 500 ul de 10% du formol tamponné neutre.
2. Jeter fixateur dans un récipient hermétique (sous une hotte chimique pour réduire l'exposition aux irritants / vapeurs toxiques).
3. Déshydrater dans une série d'éthanol (50%, 80% et 95%; 300 pl / 3 min de chaque concentration). Passez à "hybridation" étape ci-dessous.
4. Pour la fixation d'échantillon de 500 uL surface liquide minicultures, des chambres de perfusion sont descellés, et une flexibilité de chargement de gel pointe de la pipette est utilisée pour extraire l'enrichate. Pipetage rapide de haut en bas est utilisé pour aider à assurer l'élimination effective de toute restantes bande liée cellules.
5. Ensuite, l'ensemble du volume de 500 uL miniculture est transféré à un tube de centrifugation et centrifugés à 2000 xg (5 min). Le surnageant est éliminé, le culot est vortexé vigoureusement pendant 30-60 s, puis remis en suspension dans un volume égal de 10% du formol tamponné neutre. Les cellules sont fixées pendant 30 min à 25 ° C.
6. Ensuite, fixateur est enlevé et l'échantillon est remis en suspension dans un tampon de stockage des cellules, comme suit. L'échantillon est centrifugé à 2000 xg (5 min, 25 ° C) le surnageant est éliminé, le culot est vortexé vigoureusement pendant 30 - 60 s, la remise en suspension dans un volume égal de 50% éthanol non dénaturé-50% de phosphate une solution saline tamponnée. Les cellules fixées peuvent être stockées indéfiniment (ans) à -20 ° C. Note: Lorsque des liquides sont modifiées (par exemple, lorsque l'introduction d'un tampon de fixatif ou autre), il est important de bien resuspendre (avec vortex) de la cellule dans une partie minime de pellets (~ 10 - 20 pl) du système liquide "sortants" . Cela aidera à empêcher l'agglutination et d'assurer que les suspensions, même des cellules individuelles sont obtenues. Passez à "hybridation" étape ci-dessous.

4. Hybridation

1. Préparer hybridation / tampon de lavage en utilisant les commerciaux de biologie moléculaire de qualité des solutions noté dans le tableau des matériaux. Concentrations finales composant tampon de 0,7 M de NaCl, 0,1 M Tris [pH 8,0], EDTA 10 mM, du sulfate de sodium à 0,1% dodécyle, constitué au volume final désiré avec moléculaires de qualité de l'eau et filtré à l'aide d'une seringue de 0,22 um ou le filtre coupe. Le même tampon, sans l'ajout de sondes (voir ci-dessous) est utilisé comme un tampon de lavage. Préchauffer l'hybridation et le lavage tampons à 55 ° C.
2. Ajouter marqués à la fluorescence Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5'-AAT CAC GTG TTC ACC TAC-3 ') et de la Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3' ) des sondes oligonucléotidiques (Tableau Matériaux) au tampon d'hybridation préchauffé. Une concentration totale de la sonde de 5 pl ng ^-1 est utilisée (par exemple 2,5 ng ^-1 uL chaque sonde; Bisha et Brehm-Stecher, 2009a).
3. Pour direct-to-bande et l'enrichissement des échantillons solides de phase, la superposition de la zone de l'échantillon modélisé de contact de la bande avec 300 ul de tampon d'hybridation contenant la sonde et cocktail de s'hybrider bandes lié cellules dans un milieu humide, chambre d'incubation étanche fixé à 55 ° C. Si un incubateur à contact direct, comme l'instrument Moat Slide (Tableau Matériaux) est utilisée, les échantillons sont hybridées pendant 15 min et> 20 diapositives peuvent être traitées simultanément. Si un four à hybridation rotatif de style telles que l'instrument Bambino (Tableau Matériaux) est utilisé, les lames sont placées dans des tubes de centrifugeuse de 50 ml en polypropylène pour l'hybridation, une diapositive par tube. Parce que le transfert de chaleur n'est pas direct, ces échantillons sont hybridées pour de plus longues périodes (jusqu'à 30 min).
4. Après l'hybridation, les lames sont retirés et la sonde contenant superposition tampon d'hybridation est éliminé. Les lames sont ensuite soit brièvement et doucement rincée avec un tampon de lavage préchauffée par pipetage un petit volume de tampon sur une lame inclinée (3 rinçages de 300 uL de chaque), ou officiellement lavés (jusqu'à 30 min) avec soit une superposition de tampon de lavage préchauffé ou immersion dans un tube à centrifuger en polypropylène de 50 ml contenant du tampon de lavage préchauffé. Dans notre expérience, même si un lavage régulier et offre une amélioration des résultats (moins brume de la sonde non liée), un simple rinçage est suffisante pour la détection sans ambiguïté de Salmonella spp. Ensuite, les lames sont séchées à l'air avant de passer à la "détection" étape ci-dessous.
5. L'hybridation des échantillons de liquide de surface miniculture est effectuée par le bas filer des échantillons (fraîchement fixe ou conservés dans un tampon de stockage à -20 ° C) pendant 5 min à 2000 xg, suivi par vortex vigoureux de la pastille et la remise en suspension dans 100 uL de tampon d'hybridation préchauffé contenant le cocktail de la sonde. Les échantillons sont hybridées à 55 ° C pendant 30 min sur un bloc de chaleur ou d'autres station d'incubation approprié (Tableau Matériaux), suivie par l'addition de 500 uL de tampon de lavage préchauffé. Comme avec du ruban lié échantillons, ces échantillons peuvent être officiellement lavés pour un maximum de 30 min avec une nouvelle incubation à 55 ° C dans ce tampon de lavage, avec vortex intermittente. Alternativement, les échantillons peuvent être soigneusement vortexés après ajout de 500 uL de tampon de lavage préchauffé, suivie par une récolte immédiate pour l'analyse (ci-dessous).
6. En préparation pour la détection de Salmonella spp. par cytométrie en flux, liquide des échantillons de surface sont miniculture centrifugés à 2000 xg pendant 5 min, le surnageant est éliminé et les échantillons sont remis en suspension dans 300 uL température ambiante (~ 25 ° C) PBS. Si les échantillons nécessitent un transport vers une installation éloignée, ou si un délai est prévu entre l'hybridation et l'analyse, les échantillons peuvent être réfrigérés ou détenus sur la glace avant d'Analyse. Alternativement, les échantillons peuvent être transférés à la cellule de stockage tampon (50:50 mélange de PBS et de l'éthanol absolu) et maintenue à -20 ° C jusqu'à une semaine sans perte appréciable de sonde sont conférés par fluorescence (Bisha et Brehm-Stecher, 2009b) .

5. Détection

1. Pour le bande de détection de Salmonella spp. par microscopie à fluorescence, direct-to-tape ou solides des échantillons d'enrichissement de phase sont recouvertes de 10 uL ~ Vectashield H-1200 contenant le milieu de montage nucléaires Contre 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), monté avec une lamelle, puis incubés dans l'obscurité pendant 10 min.
2. Huile à immersion est placé sur la lamelle, et les échantillons sont examinés à l'aide d'un objectif de pétrole à fort grossissement (63x ou 100x). Le filtre DAPI est utilisé pour amener l'échantillon dans le foyer, le microscope est ensuite commuté sur le filtre approprié (vert ou rouge, selon le colorant utilisé pour mettre fin à l'étiquette des sondes) et les cellules de Salmonella sont marqués visuellement selon leur fluorescence (Figures 2 et 3).
3. Pour la détection par cytométrie de liquide échantillons miniculture surface, divers instruments peuvent être utilisés, selon les disponibilités locales. Dans notre laboratoire, PBS-suspendus échantillons sont transférés dans des tubes 5 ml à fond rond d'échantillonnage (BD Falcon) et examiné en utilisant un cytomètre en flux FACSCanto avec une excitation à 647 nm (Tableau Matériaux). Pour les échantillons enrichis contenant un nombre élevé de bactéries totales, le "faible débit" de réglage (10 min uL ^-1) est utilisé et 5,000-50,000 événements sont collectés. Les données sont analysées à l'aide FlowJo logiciel (version 8.8.6, Arbre Star, Inc, Ashland, OR) ou d'autres logiciels d'analyse approprié (voir la figure 4, panneaux A et B).

6. Les résultats représentatifs

Figure 1. Utilisez du ruban adhésif pour l'échantillonnage de Salmonella spp. de la surface d'une tomate artificiellement contaminés.

Figure 2. Les résultats typiques pour direct-to-tape d'échantillonnage et de détection du poisson de Salmonella Typhimurium ATCC 14028 de la surface de la tomate (100 objectifs du pétrole X). Un cocktail de deux sondes de Texas Red sondes marquées (Sal3/Salm-63) a été utilisée d'étiqueter ces cellules.

Figure 3. Microcolonies de Salmonella Typhimurium ATCC 14028 formée sur la surface de xylose lysine Tergitol-4 (XLT-4) gélose après une h 8 sur cassette d'enrichissement à 37 ° C. L'inoculum initial a été échantillonnée à partir de la surface d'une tomate artificiellement contaminés. Solid-phase d'enrichissement augmente le nombre de cellules disponibles pour la détection et améliore également le contenu cellulaire ARNr.

Figure 4. Utilisez du ruban adhésif pour l'échantillonnage de S. enterica sérotype Typhimurium de la surface d'une tomate artificiellement contaminés, suivie par l'analyse directe via FISH et cytométrie en flux (panneau A) ou après 5 h d'enrichissement non-sélectif surface liquide miniculture dans une chambre de perfusion remplie avec 500 pi de bouillon trypticase-soja (panneau B ).

Discussion

Des méthodes simples et rapides pour la détection des pathogènes sur des surfaces de produire peut aider à atténuer les maladies d'origine alimentaire en fournissant des données pertinentes et appropriées. Adhésif méthodes d'échantillonnage basés sur la cassette ont été utilisés dans l'environnement, clinique et de microbiologie alimentaire depuis les années 1950 et impliquent appuyant sur "Scotch" style de bande à des surfaces pour l'élimination des microorganismes, suivi par l'examen microscopique direct ou transfert de microorganismes adhérents aux médias solide pour croissance (Barnetson & Milne, 1973; Edwards & Hartman, 1952; Evancho et al, 2001;. Fung et al, 1980;. Lakshmanan & Schaffner, 2005; Langvad, 1980). Une modification récente décrit la combinaison de la base de bandes d'échantillonnage avec l'hybridation fluorescente in situ (FISH) pour la culture indépendante d'analyse de micro-organismes colonisent les surfaces des monuments de pierre (La Cono & C. Urzì, 2003). Nous avons appliqué une approche similaire pour échantillonnage rapide et la détection des Salmonella présentes sur les produits frais, notamment les tomates, les épinards et les piments jalapeños (Bisha et Brehm-Stecher, 2009a). Ruban adhésif peut être utilisé pour enlever les cellules de ces aliments et les échantillons peuvent ensuite être transformés destinés aux poissons et visualisé par microscopie à fluorescence. De cette façon, aussi peu que 10 ³ UFC Salmonella cm ^-2 (la limite de détection pour les méthodes de microscopie à base) peuvent être détectés sur les produits frais au sein de ~ 1,5 - 2 h. Alternativement, courte (8 h) enrichissements en phase solide peut être effectuée en plaçant la face bande de cellules chargées vers le bas sur gélose sélective, et les microcolonies résultant détectée par FISH. En superposant la bande avec ≤ 500 ul des milieux liquides, ruban-échantillonnés cellules de Salmonella peut être détaché et détecté directement après poissons en utilisant la cytométrie en flux (Figure 4, partie A). Brève incubation (~ 5 h) de ces minicultures liquide non sélective permet un enrichissement substantiel de bactéries, avec des cellules de Salmonella facilement détectée dans des mélanges complexes de cellules cibles et non cibles après le poisson (figure 4, panneau B). Collectivement, nos résultats démontrent que cette approche fournit une nouvelle méthode pour l'extraction, la présentation et l'identification des bactéries spécifiques présents sur les tomates et autres produits frais. Bien que nous avons décrit l'utilisation de base d'ADN sondes ici, il est probable que cette approche pourrait également être élargi pour inclure la sonde chimies alternatifs, tels que les acides nucléiques peptides (PNA), pour lequel Salmonella sondes spécifiques ont également été décrites (Almeida et al., 2010).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungi-Tape sampling tape	Scientific Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It sampling tape	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Clear office tape, generic	Various		Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence
Food surface	Local Grocery Store		Tomat–s (red tomat–s on the vine, not waxed or oiled) used here
Trypticase Soy Broth	Difco Laboratories	211768	For non-selective liquid surface miniculture enrichment
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base	Difco Laboratories	223420	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement	Difco Laboratories	235310	For Salmonella-selective agar (XLT-4)
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT5011	10% solution, neutral, buffered (cell fixative)
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)
1.5 ml microcentrifuge tubes	Various		RNase- and DNase-free
Microscope slides and cover slips	Thermo Fisher Scientific, Inc.
NaCl solution	Sigma-Aldrich	S5150	Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma-Aldrich	L4522	10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes	Integrated DNA Technologies		5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified
Variable speed microcentrifuge	Various		Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol
CoverWell perfusion chamber	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Non-sterile
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber
Aluminum heat block or precision-controlled heating station	Various		Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here
Bambino mini hybridization oven	Boekel Scientific	Model 230300	Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct
Slide Moat slide hybridizer	Boekel Scientific	Model 240000	Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain
Fluorescence microscope	Various		Leitz Laborlux S used here
Digital camera	Various		Canon PowerShot A640 camera used here
Image acquisition software	Various		Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used
Adobe Photoshop	Adobe		For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)
Flow cytometer	Various		FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used
Flow cytometry analysis software	Various		FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used