Summary
Larvale zebravis vormen de eerste gewervelde modelsysteem om gelijktijdig patch clamp opnamen toestaan van een spinale motor-neuron en target skeletspieren. Deze video toont de microscopische methoden die worden gebruikt om een segmentale CaP motor-neuron en doel spiercellen, alsook de methodologieën voor het opnemen van elk celtype te identificeren.
Abstract
Larvale zebravis vormen de eerste gewervelde modelsysteem om gelijktijdig patch clamp opnamen toestaan van een spinale motor-neuron en doel spier. Dit is een direct gevolg van de toegankelijkheid van beide celtypen en de mogelijkheid om de single segmentale CaP motor-neuron visueel te onderscheiden op basis van de morfologie en de locatie. Deze video toont de microscopische methoden die worden gebruikt om een CaP motor-neuron en doel spiercellen, alsook de methodologieën voor het opnemen van elk celtype te identificeren. Identificatie van de Cap motor-neuron type wordt bevestigd door een kleurstof te vullen of door de biofysische eigenschappen zoals actiepotentiaal golfvorm en cel ingangsweerstand. Motor-neuron opnames routinematig duren een uur toestaan op lange termijn opnames van meerdere verschillende doelgroepen spiercellen. Controle over de motor-neuron vuren patroon maakt metingen van de frequentie-afhankelijkheid van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie. Vanwege een grote quantale formaat en het lage geluidsniveau door hele cel voltage clamp, kunnen alle van de unitaire gebeurtenissen worden opgelost in de spier. Deze functie maakt studie van de basis synaptische eigenschappen zoals afgifte-eigenschappen, blaasje recycling, evenals synaptische depressie en facilitering. De voordelen van deze in vivo voorbereiding eclipse vorige neuromusculaire model bestudeerde systemen, waarbij de motor-neuronen worden meestal gestimuleerd door extracellulaire elektroden en de spieren te groot zijn voor de hele cell patch clamp. De zebravis voorbereiding is vatbaar voor het combineren van elektrofysiologische analyse met een breed scala van benaderingen waaronder transgene lijnen, morfolino knockdown, farmacologische interventie en in vivo beeldvorming. Deze benaderingen, in combinatie met het groeiende aantal neuromusculaire ziekten modellen die door mutant lijnen van zebravis, de deur open voor nieuwe begrip van de menselijke neuromusculaire aandoeningen.
Protocol
1. Voorbereiding van de Vis voor Gekoppelde Recordings
- Voorafgaand aan het begin van de procedure, voor te bereiden vijf belangrijke oplossingen, waaronder: Bad Solution, bad Oplossing met tricaïne (MS222), bad Oplossing met Formamide, Neuron Interne Solution en Muscle interne oplossing.
- Vervolgens verzamel een enkele larvale zebravis in de leeftijd van 72 tot 96 uur en de plaats in Bath Oplossing met tricaïne. Binnen een minuut van de blootstelling aan de narcose, zal de vis niet reageren op aanraking.
- Leg de vis op de top van een plastic schaaltje en, met behulp van een stereomicroscoop, onthoofden met een dubbele rand scheermesje.
- Breng de vis op een glazen opname kamer bedekt met Sylgard en gevuld met bad Solution. Bevestig aan de uiteinden door het invoegen van elektrolytisch aangescherpte wolfraam pinnen via de notochord.
- Maak een huidflap de buurt van de rostrale einde van de vis met een pin die een voldoende grip voor een paar fijne tang zal bieden. Verwijder de overliggende huid door vastgrijpen het in de buurt van de rostrale pin met een paar fijne pincet. Peel langzaam in de caudale richting om de huid te verwijderen.
- Behandel de vis met 3 ml van Bath Oplossing met Formamide gedurende 3-5 minuten om spiersamentrekkingen die kunnen interfereren met opnames te blokkeren. Was 5 keer met een normaal bad Solution. Verwijder een deel van de oppervlakkige laag van de spier in 5 tot 6 segmenten door voorzichtig sloop met de zijkant van een wolfraam pin.
- Breng de vis op een rechtop microscoop in een kooi van Faraday om elektrische ruis schild. De microscoop is uitgerust met een vast podium, lange werkafstand 40x objectief en zoom van 0,5 tot 4x. De microscoop is gemonteerd op een gemotoriseerde XY vertaling fase in om de voorbereiding tussen zenuw en spier onder een hoog vermogen te verplaatsen. Het gebruik van differentieel interferentie contrast optiek helpt bij het visualiseren van de neuronen.
- Onder de 0,5 x zoom, gebruik van een breed boring 15-micron pipet naar bovenliggende spier te verwijderen en het ruggenmerg bloot te leggen. Negatieve druk wordt aangebracht door middel van een 3 cc wegwerpspuit en spiercellen worden verwijderd een voor een. Deze procedure wordt herhaald voor 5 tot 6 dorsale segmenten van de skeletspieren. Dezelfde brede boring pipet wordt gebruikt om ook verwijderen van de bovenste twee lagen van ventrale spieren te richten op een snelle skeletspieren te verkrijgen.
- Hiermee is de voorbereiding voor gepaarde opnames en de microscoop zoom is verhoogd tot ongeveer 1,6 x.
2. Gepaarde Opnamen van Cap Motor-neuron en Target Muscle Cellen
- De gereinigde segmenten worden gescand om de CaP neuronen te vinden. Elke hemi-segment van het ruggenmerg bevat een groot, 10 micron diameter, CaP motor-neuron. Deze traanvormige soma is oppervlakkig gelegen onder de spinale dura de buurt van de caudale meest einde van de segmentale grens. Een CaP neuron is gekozen voor het opnemen en het ventrale doel spier in de aangrenzende caudale segment wordt gescand om de integriteit te controleren.
- Twee patch elektroden zijn geplaatst voor het opnemen, een voor de neuron en een tweede voor de spier. De bovenste elektrode heeft een ondiepe conus voor penetratie van de stoere spinale dura en de tip opening van ongeveer 2 micron. De onderste elektrode heeft een steilere conus voor lage weerstand voltage clamp-opname van de skeletspieren
- Plaats de elektrode neuron in een hoek van ongeveer 30 graden aan de spinale dura dringen, ongeveer een half-segment rostraal van de geselecteerde CaP neuron. Vooraf de elektrode met behulp van een axiale aandrijving manipulator, terwijl het aanbrengen van een zachte continue positieve druk van ongeveer 60 millimeter kwik. Omdat de elektrode breekt door de dura, kan de CaP neuron worden verdrongen door de perfusie van de elektrode, die een aanpassing van de focus.
- Wanneer de elektrode raakt de CaP neuron soma positieve druk wordt vrijgegeven en meestal resulteert in de onmiddellijke vorming van een gigaohm afdichting. Echter, in sommige gevallen een afdichting niet vorm aan, wordt het noodzakelijk om een lichte negatieve druk toe te passen. Na de vorming van afdichting, is de elektrode potentieel aangepast aan-80mV en de toepassing van negatieve druk scheurt het celmembraan. De Cap neuron wordt gekenmerkt door een input weerstand van 140 tot 180 Mega-ohm en een actiepotentiaal dat schiet +40 millivolt. Dit wordt getoetst door het injecteren van stapsgewijs verhogen depolariserende stappen onder de huidige klem totdat de actiepotentiaal wordt opgewekt.
- Vervolgens wordt de microscoop verplaatst naar ventrale spieren met behulp van de XY-gemotoriseerd vertaler onder hoge vermogen. Een snelle spiercel is gekozen uit het doel veld.
- De spier elektrode is gevorderd in de richting van het doel spiercel onder positieve druk, die, wanneer losgelaten, vormt een gigaohm afdichting. De elektrode potentieel is aangepast tot -50 millivolt naar natrium kanalen inactiveren en onder zachte zuigen de celmembraan is gescheurd. Een daling van de weerstand tegen tot 100 tot 200 Mega-ohm en de plotselinge verschijning van de grote capacitieve transiënten signalen entry.
- Om te testenvoor gepaarde opname, de motor-neuron is gedepolariseerd door stapsgewijs grotere injecties van stroom af tot een actiepotentiaal wordt opgewekt. Op dit punt een eindplaat stroom moet worden opgewekt in de spier. Voortzetting van stimulatie van de motorneuron op een Hertz resulteert in een eindplaat stromingen zonder falen. Als de stimulus frequentie wordt verhoogd tot 100 Hertz de eindplaat stromingen fluctueren in amplitude en ondergaan functionele uitputting binnen de 10 seconden van de stimulatie.
3. Representatieve resultaten
Typisch, het neuron opname is stabiel tot maximaal een uur, maar de spiercellen verslechteren zoals blijkt als een toename van de serie weerstand. Wanneer dit gebeurt het experiment is of beëindigd of een andere spier cel patch geklemd. Alle opnames moeten binnen een uur.
Figuur 1. Opnames van het motorneuron actiepotentiaal (AP, boven) en de bijbehorende spier eindplaat huidige (EPC, onderaan). De actie potentieel voor een CaP neuron moet overschrijding +40 mV en de EPC moet stijgen binnen de 300 μsec en verval langs een exponentiële tijdsverloop met een tijd constant onder 1 msec.
| Naam | Recept |
| Bath Solution (in mm) | 134 NaCl, KCl 2,9, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl 2, 10 Glucose, 10 Na-HEPES, pH 7,8 |
| Bath Oplossing met tricaïne | Bath Oplossing bevattende 0,02% tricaïne |
| Bath Oplossing met Formamide | Bath Oplossing bevattende 2M formamide |
| Neuron interne oplossing (in mm) | 115 K-gluconaat, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-ATP, pH 7,2 |
| Muscle interne oplossing (in mm) | 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7,4 |
Tabel 1. Solutions.
Discussion
We hebben met behulp van zebravis gepaarde opnamen (Wen en Brehm, 2005) vooral om de processen van het blaasje release en recycling studie tijdens hoogfrequente stimulatie. Dit proces wordt verstoord in motiliteit mutanten waarin normale synaptische transmissie in het gedrang te wijten aan puntmutaties synaptische in de belangrijkste onderdelen. Bijvoorbeeld mutaties die postsynaptische receptor aggregaten (Ono et al.., 2001, 2002, 2004) en de synthese van presynaptische zender (Wang et al., 2008). Resulteren in niet-gecoördineerde zwemmen verstoren. Gekoppeld opnames de informatie dat de bron van de functionele defect kunnen lokaliseren, dus het koppelen van gedrag, genetica en fysiologie. Het zou nu mogelijk zijn om verder te ontleden van de processen die ten grondslag liggen synaptische transmissie door middel van voorbijgaande expressie in het CaP motor-neuronen met behulp van oordeelkundige promotors. Op deze manier dominant negatief of gemuteerde genen specifiek kan worden uitgedrukt in deze neuronen en zowel gedrags-en elektrofysiologische gevolgen bepaald. De extra voordeel van de hele cel configuratie maakt het mogelijk dialyse van het GLB soma met middelen die mogelijk kunnen veranderen blaasje recycling, zoals Clostridium-toxinen en calcium buffers. Vanwege de korte afstand tussen de soma en de spieren, moeten diffusie goed gebeuren binnen het tijdsbestek van de opnamen. Het potentieel van dit preparaat is alleen begonnen met worden aangeboord. De transparantie van de vis op deze leeftijd en oppervlakkige ligging van synapsen maakt ook gebruik van optische hulpmiddelen (Fetcho en O'Malley, 1997; Fetcho en Higashijima, 2004). We zijn zeer succesvol geweest in het meten van endo-en exocytose in levende vis met behulp van FM-kleurstoffen en genetische indicatoren, zoals Synaptophluorin (Li et al.., 2003). Daarnaast kunnen fluorescerende geconjugeerd gifstoffen worden gebruikt om de synaptische proteïnen label voor de beeldvorming van levende vis (Ibanez-Tallon et al., 2004).. Gezien de eenvoud van deze voorbereiding in zijn bezit een grote belofte voor de toekomst te bestuderen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Gefinancierd door de NIH (NS-18205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pneumatic transducer tester | Fluke Biomedical | DPM1B | |
| 0.002 x 3 inch tungsten rod | A-M Systems | 715000 | |
| Sylgard 184 Elastomer | Dow Corning | The thickness of application will affect the DIC optics |
References
- Fetcho, J. R., O'Malley, D. Imaging neuronal networks in behaving animals. Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).
- Fetcho, J. R., S, H. igashijima Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish. Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).
- Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo. Neuron. 43, 305-311 (2004).
- Li, W., Ono, F., Brehm, P. Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors. J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).
- Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish. J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).
- Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse. J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).
- Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function. J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).
- Wang, M., Wen, H., Brehm, P. Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan. J Neurophysiol. , 100-104 (2008).
- Wen, H., Brehm, P. Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).
