Method Article

Протокол по производству Генетические Креста Паразиты грызунов малярией

DOI:

10.3791/2365

⸱

January 3rd, 2011

 ,  , 
1National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2School of Life Science, Xiamen University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генетические кресты паразитов малярии грызунов проводится путем подачи двух генетически различных паразитов комаров. Рекомбинантный потомства клонированных из крови мышей после учета комары кусать зараженных мышей. Это видео показывает, как производить генетические кресты Plasmodium yoelii И применим и к другим малярийных паразитов грызунов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изменения в ответ на противомалярийных препаратов и патогенность малярийных паразитов имеет биологическую и медицинскую значимость. Связь отображение привело к успешной идентификации генов или локусов лежащий в основе различные черты в малярийных паразитов грызунов и человека 1-3 4-6. Малярийного паразита Plasmodium yoelii является одним из многих видов малярии, изолированных от диких африканских грызунов и была адаптирована для роста в лабораториях. Этот вид воспроизводит многие биологические характеристики человека малярийных паразитов; генетических маркеров, таких как микроспутник и усиливаются полиморфизма длины фрагмента (AFLP) маркеры были также разработаны для паразита 7-9. Таким образом, генетические исследования возбудителя малярии грызунов могут быть выполнены в дополнение к исследованиям на Plasmodium тропической. Здесь мы демонстрируем методы получения генетического крест в P. yoelii, что впервые были пионерами докторами. Дэвид Walliker, Ричард Картер, и его коллеги из Эдинбургского университета 10.

Генетические крестов в P. yoelii и других паразитов малярии грызунов проводятся путем заражения мышей Mus мышцы с посевной содержащие гаметоциты двух генетически различных клонов, отличающихся фенотипов интереса и позволяя комаров кормить на зараженных мышей через 4 дня после инфицирования. Наличие мужского и женского гаметоциты в кровь мыши микроскопически подтверждено перед кормлением. В течение 48 часов после кормления, в средней кишке комаров, гаплоидный гаметоциты дифференцироваться в мужской и женской гамет, удобрять и образуют диплоидные зиготы (рис. 1). Во время развития зиготы в ookinete, мейоз появляется происходить 11. Если зиготы происходит через перекрестное опыление между гаметы из двух генетически различных паразитов, генетический обмен (хромосомная рекомбинации и кроссоверов между не-сестринских хроматид из пары гомологичных хромосом;. Рис. 2) может иметь место, в результате рекомбинации генетического материала на гомологичных локусов. Каждая зигота претерпевает два последовательных делений ядра, что приводит к четыре гаплоидных ядер. Ookinete дальнейшем перерастает в ооцисты. После ооцисты созревает, тысячи спорозоитов (потомство крест) формируются и выпущены в hemoceal комара. Спорозоиты собирают из слюнных желез и вводят новые мышиные хозяин, где пре-эритроцитарных и эритроцитарных этапе развития имеет место. Эритроцитарных форм клонируются и классифицируются исходя из отличительных символов родительских линий до генетического картирования связи. Управление инфекций индивидуальных родительских клонов выполняются таким же образом, как производство генетической крест.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Асептический методы должны применяться ко всем материалам, которые будут администрируемых в животных, чтобы избежать случайного введения экзогенных инфекционных агентов в организм мышей, которые можно смешивать экспериментальных результатов.

1. Заражение лабораторных мышей с кровью стадии малярийных паразитов

  1. При комнатной температуре таяния флаконах, содержащих по два замороженных паразитов этапе крови малярии должны быть скрещены. В этом примере два грызуна штаммы малярийного паразита Plasmodium используются yoelii yoelii и Plasmodium yoelii nigeriensis.
  2. Fit шприц с 22-30 колеи (G) иглы и ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы демонстрируем методы для производства генетических крест грызунов малярии Plasmodium yoelii, которое также применимо к производству генетического кресты и в других малярии грызунов. Инфекции мышей с одной родительской клоны, как правило, проводится для определения успешной передачи родительских паразитов, чтобы родители компетентных в производстве функциональных гамет перед выполнением крест.

Успешная передача через комара зависит от нескольких факторов, включая температуру insec.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Потому что авторы являются правительственными служащими, и это государственная работа, работа находится в общественном достоянии в США. Независимо от других соглашений, NIH оставляет за собой право на предоставление работы PubMedCentral для отображения и использования общественных и PubMedCentral могут теги или модифицировать его в соответствии со своей обычной практики. Вы можете установить права вне субъекта США в лицензии на использование правительством.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Рэнди Элкинс, Робин Kastenmayer, Тед Торри, Дэн Паре и Tovi Lehman за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана Внутренние программы исследований Отдела Внутренние исследований, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, а также 973 Национальные программы фундаментальных исследований Китая, # 2007CB513103. Мы благодарим NIAID очной редактор Бренда Маршалл Рей об оказании помощи.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ:

  • Техническое обслуживание лабораторных мышей
  • Техническое обслуживание лабораторных комаров
  • Микроскопическое исследование тонких мазков крови окрашивали Гимза
  • Измерение плотности красных клеток крови

Техническое обслуживание лабораторных мышей

Самки мышей инбредных штамм лаборатории BALB / с, в возрасте от 5 до 8 недель, которые используются в исследовании. Мыши размещены в стандартном твердого поликарбоната нижней клетке с проволокой-бар крышкой, оснащенной фидера и бутылку воды. Мыши поддерживается при постоянной температуре (25 ± 1 ° С) на 12:12 час свет: темно-цикла. Мыши могут питаться 2018S Харлан Teklad Глобальный 19% белка экструдированного диеты грызунов (стерилизация, от Харлан-Teklad) и поставляется с подкисленной питьевую воду без ограничений. Эксперименты на животных проводятся в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными уходу и использованию животных комитетом на Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний по протоколу LMVR11E (Национальный институт здоровья, Бетезда, штат Мэриленд).

Техническое обслуживание лабораторных комаров

Комары из лаборатории воспитанный колонии Anopheles stephensi. Взрослые ведутся в нейлоновых клетки хранятся в температуре и влажности контролируемой комнате (от 23 до 25 ° С для плазмодия Plasmodium yoelii и chabaudi, и 19 до 21 ° С в течение Plasmodium berghei; от 80 до 95% влажности, с 12:12 часов свет: темно-цикла). Взрослые комары питаются 10% глюкозы и 2,00% парааминобензойной кислотой (ПАБК) дополнить водного раствора. Для получения высококачественных взрослых, 500 личинок, выращенных в низкой плотности состояние в 1 л дистиллированной воды в 1000 см 3 открытых блюда поставляются с примерно 1 мг натрия бикарбоната. После вылупления личинок приведены TetraMin порошка (PETCO), пока они не перерастают в стадии куколки и передаются в клетках взрослого комара для развивающихся.

Микроскопическое исследование тонких мазков крови окрашивали Гимза

Использование чистых ножницами отрезать кончик (1,0 мм), хвоста инфицированные мыши. Поместите одну каплю (0,5-1,0 мкл) хвоста кровь на чистую слайд образца. Мышь будет остановить кровотечение в течение 1-2 мин. Место чистое слайд разбрасыватель на вершине капли крови, поддержание его на угол 45 ° по отношению к образцу слайдов, и позволяют крови адсорбироваться на всю ширину шпателя. Держите образец слайдов и продвигать разбрасыватель слайд быстро и плавно производить тонкий мазок. Пусть кровь фильм сухой, а затем погружают слайды в абсолютном метаноле. Разрешить слайд высохнуть на воздухе еще раз перед покрывая ее Гимза (10% Гимза красителя в дистиллированной воде). После инкубации тонких пленок крови в течение 10-15 минут при комнатной температуре, тщательно промойте слайды с водопроводной водой и дайте ему высохнуть на воздухе. Проверьте количество зараженных эритроцитов (iRBC, см. рисунок 3 для морфологии зараженных РБК) под световым микроскопом с погружением нефть на увеличение 1000x (с объективом 100х) и вычислим паразитемии (количество iRBC на 100 РБК в счет). Различные штаммы малярийных паразитов различаются по скорости роста и патогенности. Мониторинг parasitaemias крови этап может быть выполнен за 24 часа после инъекции, в зависимости от дозы крови паразиты стадии малярии. Например, мыши будет положительным микроскопически 24 часов при введении с 10 7 инфицированных РБК внутрибрюшинно или 10 6 инфицированных РБК внутривенно.

Измерение плотности красных клеток крови

Как уровни parasitaemias, красных кровяных клеток (эритроцитов) плотности в зараженных мышей изменяется в течение всего инфекция. РБК плотности следует измерять в течение 1-2 часов до начала одно-и смешанных инфекций и клон клонирование экспериментов. Есть два метода для измерения плотности РБК: ручного подсчета использованием Нойбауэр гемоцитометра и автоматического подсчета использованием Cellometer (Nexcelom Bioscience). В обоих методах, снять 1 мкл мыши хвост крови с помощью стеклянного капилляра (VWR) и разбавить в 10 мл PBS и хорошо перемешать. Для использования гемоцитометра Нойбауэр, нагрузка 20 мкл суспензии на hemacytometer. Место hemacytometer на световой микроскоп с 10-кратным объективом. Hemacytometer содержит сетки разделена на 9 больших площадях, и 4 больших площадей на углу свою очередь делятся на 16 маленьких квадратов. Подсчитать общее число ячеек в каждой из 16 малых квадратов в четыре квадрата угла. Чтобы избежать предвзятости или подсчет подсчетом клетки, которые накладываются линии сетки, граф клетки как "в", перекрывает ли он сверху или правой линии и "вне", перекрывает ли он вниз или слева линий. Оцените число клеток на один маленький квадрат и разделить на 0,00625 (объем одной небольшой площади 6,25 NL). Это дает число клеток на микролитр (&му, L). Исходя из этих данных, вычислить окончательный красный плотность кровяных клеток путем умножения на 10 тысяч (коэффициент разбавления). Промыть скольжения крышкой и счетной камеры с дистиллированной водой и 70% этилового спирта; высохнуть на воздухе. Кроме того, нагрузка 20 мкл суспензии на камеру слайд подсчета Cellometer. Вставьте слайд в Cellometer камере слайд (читателя). Начало Cellometer программного обеспечения, выберите "красных клеток крови" вариант, и введите коэффициент разбавления 10000. Запись плотности РБК.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).
  2. Cravo, P. V. Genetics of....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Genetic CrossPlasmodium yoeliiRodent MalariaMosquito FeedingSporozoite HarvestBlood Stage ParasitesGametocyte DetectionOocyst FormationSporozoite InjectionLimited Dilution

Related Articles