Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen

Summary

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om te ontleden, transfecteren via elektroporatie en cultuur muis hippocampus en corticale neuronen. Op korte termijn culturen kan worden gebruikt voor studies van axon uitgroei en begeleiding, terwijl de lange-termijn culturen kunnen worden gebruikt voor onderzoek naar synaptogenese en dendritische rug analyse.

Abstract

Hippocampus en corticale neuronen zijn uitgebreid gebruikt voor het centrale zenuwstelsel (CZS) neuronale polarisatie, axon / dendriet uitgroei, en synapsvorming en functie te bestuderen. Een voordeel van het kweken van deze neuronen is dat ze gemakkelijk polariseren, de vorming van onderscheidende axonen en dendrieten, op een twee dimensionale substraat bij zeer lage dichtheden. Deze eigenschap heeft hen zeer nuttig voor het bepalen van vele aspecten van de neuronale ontwikkeling. Bovendien, door het verstrekken van glia-conditioning voor deze neuronen ze zullen blijven ontwikkelen, de vorming van functionele synaptische verbindingen en overleven enkele maanden in de cultuur. In dit protocol schetsen we een techniek te ontleden, cultuur en transfecteren embryonale muis hippocampus en corticale neuronen. Transfectie wordt bereikt door electroporating DNA in de neuronen voor het uitplaten via nucleofection. Dit protocol heeft het voordeel te drukken fluorescent-gemerkte fusie-eiwitten vroeg in de ontwikkeling (~ 4-8uur na plating) om de dynamiek en de functie van eiwitten te bestuderen tijdens de polarisatie, axon uitgroei en vertakking. We hebben ook ontdekt dat dit ene transfectie voordat plating fluorescent-gelabelde fusie-eiwit expressie blijft op een niveau dat geschikt is voor beeldvorming gedurende de hele levensduur van het neuron (> 2 maanden in cultuur). Zo, deze methodiek is handig voor het bestuderen van eiwitten lokalisatie en de functie heel CNS ontwikkeling met weinig of geen verstoring van de neuronale functie.

Protocol

1. Voorbereiding van Dekglaasjes en Kamers

1. De voorbereiding van schone coverslips en kamers is essentieel voor een gezonde culturen. Snelkoppelingen mag niet worden ingenomen op een van deze stappen.
2. Was de dekglaasjes (12mm of 22mm rond, Duits glas - Carolina Assistant Brand) overnachting in geconcentreerd salpeterzuur (HNO3) in een speciale glazen pot of beker.
3. Verwijder de dekglaasjes van salpeterzuur en was uitgebreid (5-7x) in gedeïoniseerd water.
4. Scheiden de dekglaasjes en droog in een laminaire stroming kap of bioveiligheid kast. Bij het droog, steriliseren ze met UV-licht gedurende 30 minuten. Plaats gesteriliseerd coverslips in een steriele Petrischalen voor opslag. Als plating neuronen op 12mm dekglaasjes direct plaatsen dekglaasjes in een steriele 35mm schotel en ga verder met deel 2.
5. Imaging kamers zijn gebouwd door het boren van een 15mm gat in de bodem van 35mm petrischalen (verwijder alle bramen) en het bevestigen van de gereinigde dekglaasjes met een 3:1 mengsel van paraffine en vaseline.
6. Smelt de paraffine / vaseline mengsel in een conische buis in een bad met kokend water. Gebruik een kleine kwast en vacht de onderkant van de schotel rond de 15mm gat. Zorg ervoor dat blijf roeren de paraffine / vaseline mengsel als het zal scheiden. Dit resulteert meestal in kamers, samen met een hogere concentratie van vaseline, die viskeus wanneer gerechten worden geplaatst in de incubator, wat resulteert in dekglaasje onthechting gelijmd. De overige paraffine / vaseline kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur.
7. Zet de schaal ondersteboven op een vlakke lade en plaats het dekglaasje over het gat. Verhit in 80 ° C oven tot paraffine mengsel gesmolten is (~ 10 minuten). Verwijder de gerechten op een vlakke ondergrond en laat het mengsel paraffine in te stellen.
8. Draai de gerechten op en steriliseer zowel de binnenkant van de covers en de bodem van de kamers met UV-licht.
9. Coat coverslips of glazen regio's van de kamers met 1.0mg/mL Poly-d-lysine (30kDa) in boraat buffer (0,1 M natriumboraat, pH 8,5) gedurende een uur. Spoel 3-5 maal overvloedig met weefselkweek kwaliteit gedeïoniseerd water. Zorg ervoor dat alle sporen van boraatbuffer te verwijderen. Droog en onmiddellijk gebruiken of op te slaan kamers / dekglaasjes voor later gebruik. We gebruiken meestal gereinigd dekglaasjes binnen een maand van voorbereiding.

2. Voorbereiding van Neuronale Dissection en Cultuur Medium

1. Bereid de dissectie medium (DM) door het toevoegen van de juiste hoeveelheden van 10x HBSS en 100x HEPES aan weefselkweek kwaliteit water. Bewaren bij 4 ° C. Blijf op ijs tijdens de dissectie.
2. De dag voor de dissectie de voorbereiding van de beplating medium (PM) en serum-vrij medium (SFM). PM bestaat uit Neurobasal Medium, B27 supplement, 2 mM glutamine, 0,3% glucose, 37,5 mM NaCl en 5% foetaal bovine serum (FBS). SFM bestaat uit Neurobasal Medium, B27 supplement, 2 mM glutamine, 0,3% glucose en 37,5 mM NaCl.
3. Maak alleen genoeg voor de dissectie en op te slaan in een weefselkweek incubator 's nachts met de dop op een kier, zodat de temperatuur en de CO _2-gehalte van het medium evenwicht houdt. We voegen extra glucose en verhoging van de osmolaliteit tot ongeveer 310mOsm met NaCl. We vinden de cultuur beter te doen op een meer fysiologische osmolaliteit (Neurobasal osmolaliteit is typisch 205-245mOsm).

3. Corticale gliale Feeder Layer Voorbereiding voor de lange termijn culturen

1. Als lange termijn culturen te worden voorbereid, voert dit deel van het protocol twee tot drie weken voordat u verder gaat met de corticale of hippocampus dissecties.
2. Bereid gliale medium (GM) met MEM, 0,3% glucose, penicilline / streptomycine en 10% paard serum.
3. Euthanaseren P1-P3 muis pups door afkoeling op ijs gedurende 5 minuten. Verwijder elk pup uit het ijs en spuit met 70% ethanol. Snel onthoofden met een schaar. Verwijder de gehele hersenen om een ​​schotel met koud DM (stap 2.1).
4. Verwijder de twee hersenhelften en hersenvliezen. Accijnzen de neocortex en te verwijderen om een ​​nieuw gerecht bevat geen media. Bereid cortex van 4 hersenen totaal.
5. Gehakt van de cortex met een schone, steriele scheermesje zo fijn mogelijk en verwijder stukjes weefsel met een plastic pipet aan op een 50 ml conische buis met 12 ml koud DM. Voeg trypsine en DNase tot de uiteindelijke concentratie van 0,25% (1,5 ml) en 0,1% (1,5 ml), respectievelijk. Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 10 minuten met intermitterende wervelende.
6. Haal de buis met de corticale tissue en reinig grondig met 70% ethanol alvorens in de weefselkweek kap. Pipet corticale weefsel op en neer met een 10 ml pipet ongeveer 10-15 keer, of tot de meeste brokken verdwijnen.
7. Zet de buis tot 37 ° C in een waterbad nog 10 minuten met intermitterende wervelende.
8. Grondig reinigen van de buis met 70% ethanol en terug te brengen naar de weefselkweek kap. Pipet de corticale weefsel op en neer met een 5 mL pipet circa 10-15 keer, of tot de stukken verdwijnen.
9. Voeg 15 ml warm GM en centrifugeer bij 200xg (1000 tpm) gedurende 10 minuten.
10. Supernatant Gooi, resuspendeer de gepelleteerde cellen in 20 ml vers GM en tellen met een hemocytometer. Plaat 5-7.5x10 ⁶ cellen in 15 ml van GM per 75cm ² kolf.
11. Na een dag en om de 2-3 de daaropvolgende dagen in cultuur, verjagen losse cellen door kloppen de kolf tegen je hand. Verwijder het medium samen met eventuele verdreven cellen en te vervangen door 15 ml vers GM.
12. Glia kan worden geoogst na 1-2 weken van de groei in de kolven, als ze ongeveer 70-100% confluent. Ter voorbereiding op de individuele coverslips bedekt met glia, plaats 6 salpeterzuur gereinigd en gesteriliseerd 25mm ronde dekglaasjes in een 10cm schotel, en plaats 3 punten van het 3:1 mengsel van paraffine / vaseline op elk dekglaasje in een driehoekig patroon met een kleine kwast . Behandel openen schotels met UV-licht gedurende 30 minuten. Coat de dekglaasjes met 0,1 mg / ml poly-D-lysine (30kDa) in boraatbuffer voor een uur, daarna uitgebreid wassen (3-5x) met steriele weefselkweek kwaliteit gedeïoniseerd water en laten drogen.
13. Verwijder de gliale-bevattende kolf van incubator, gooi het medium en spoel na met 5 ml van de voorverwarmde trypsine / EDTA-oplossing. Verwijder de trypsine / EDTA-oplossing uit de kolf en pipet 3 ml vers voorverwarmde trypsine / EDTA in de fles. Incubeer de kolf gedurende 1 minuut bij 37 ° C voor het toevoegen van 5 ml van GM om de behandeling met trypsine te stoppen.
14. Haal de glia uit kolf door herhaald pipetteren 10-15 keer, en vervolgens over de media om een ​​15 ml conische buis. Centrifugeer op 200xg (1000 tpm) gedurende 8 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 10 ml van GM, tellen cellen, en de plaat 5x10 ⁵ cellen in 12,5 ml van GM per 10cm schotel met de dekglaasjes.
15. Exchange het medium met verse voorverwarmd GM om de 2-3 dagen. De dag voor de neuron dissectie, verwijder de GM en te vervangen door SFM (paragraaf 2.2). Gebruik deze gliale-conditioning SFM bij stap 4.12 bij overstromingen corticale of hippocampus culturen.

4. Corticale en / of de hippocampus Dissection en Elektroporatie

1. Verwijder de juiste hoeveelheden nucleofection oplossingen (Lonza), combineren en opwarmen tot kamertemperatuur voordat u de dissectie. Sinds Nucleofection oplossing heeft een beperkte levensduur wanneer deze wordt gecombineerd, we alleen samen de benodigde bedrag voor elke bereiding (100 ul per transfectie).
2. Euthanaseren een zwangere muis op E15.5 met CO ₂ (dag van de plug is E0.5) en verwijder de baarmoeder om een 10cm petrischaal. Verwijder de foetussen en onthoofden in koude DM (paragraaf 2.1).
3. Verwijder de hele hersenen in een apart schaaltje van koude DM en met een gebogen wolfraam naald, verwijder beide neocortices. Verwijder de hersenvliezen met microforceps en plaats cortex in nieuwe schotel van koude DM. Met een kleine iris of Wecker schaar, verwijder de cortex of de hippocampus en doe dit in een 1,5 ml Eppendorf buis gevuld met 1,0 ml koud DM. Houd deze buis op ijs.
4. Na het ontleden van alle cortices of hippocampus, voeg 110 pl van 2,5% trypsine om de Eppendorf buis met het weefsel en plaats buis in een 37 ° C incubator gedurende 20 minuten.
5. Verwijder het supernatant en wassen cortex of hippocampus met 1,0 ml PM (paragraaf 2.2) door voorzichtig het omkeren van de Eppendorf buis. Tweemaal herhalen de was en laat 1 mL van PM in de buis.
6. Vermaal de brokken 15 keer met een pipet P1000, en verwijder supernatant / cellen naar een nieuwe 15 ml conische buis met 4 ml van PM, zodat alle stukken die nog in Eppendorf buis.
7. Draai de 15 ml buis 20xg (350rpm) gedurende 7 minuten met de rem af. Verwijder het supernatant en voeg 100 ul van voorgemengde, op kamertemperatuur nucleofection oplossing (Lonza) voor elke transfectie. Vermaal vijf keer met een zachte op en neer beweging van de P1000 pipet.
8. Verwijder de 100 pi van de nucleofection oplossing / cel mengsel om elke nieuwe eppendorfbuisje en voeg de juiste hoeveelheid DNA. Voor de lange termijn culturen wij over het algemeen gebruik van 1-2μg van DNA per transfectie. Echter, dit alleen etiketten een klein <10% aandeel van de neuronen in de cultuur. Wij gebruiken over het algemeen 5-10μg van DNA per transfectie of wilt een hogere transfectie-efficiëntie op korte termijn cultuur. Wij hebben gebruik gemaakt tot een totaal van 40μg van DNA bij transfectie met twee verschillende plasmiden. Plasmiden worden opgeslagen in TE-buffer bij 1μg / ul.
9. Voeg celsuspensie / DNA op de cuvet (Lonza) en electroporate de cellen in de Nucleofector (Lonza), met behulp van het programma O-005 (Mouse CNS neuronen).
10. Snel te werken, voeg 500 ul van voorverwarmde en in evenwicht uur tot de cuvette en verwijder oplossing / cellen om een ​​nieuwe 1,5 ml Eppendorf buis. Voeg genoeg PM om het volume van elke transfectie tot 1,0 ml te brengen. Tel de cellen met een hemocytometer en plaat op 3-5x10 ³ cellen / cm ² voor jonge culturen, of 5-10x10 ³ cellen / cm ² voor de lange termijn culturen. </ Li>
11. Voor de korte termijn culturen, overstroming van de 35mm cultuur gerechten met 2,0 ml warm, CO _2-evenwicht SFM na een uur in de platen. Als u dekglaasjes, hebben we een half verwijderen van de PM en vervang deze door SFM, herhaal dan nog twee keer. Ofwel overstroming van de imaging kamers of het wassen van de dekglaasjes resulteert in een zeer lage serum-gehalte (<0,5%). Op korte termijn culturen hoeven niet te worden gekweekt met een gliale feeder-laag en hoeven niet opnieuw te worden gevoed.
12. Voor de lange termijn culturen, verwijderen we een glia overdekte dekglaasje met drie punten van paraffine / vaseline en keer het over de 15mm gat in de 35mm schotel, een uur na de eerste plating. Twee ml van het geconditioneerde SFM van de gliale schotel wordt vervolgens toegevoegd aan de beeldvorming kamer. Te voeden op de lange termijn culturen, verwijderen we een derde van de SFM om de 2-3 dagen en te vervangen door frisse, voorverwarmd en CO _2-evenwicht SFM.

5. Representatieve resultaten:

Figuur 1. Wonen hippocampale neuronen in opeenvolgende stadia van ontwikkeling. Gepaarde beelden van representatieve leven hippocampus neuronen worden weergegeven als zowel een differentieel interferentie contrast beeld en een bijbehorende fluorescerende micrograaf. Elk van deze cellen is getransfecteerd met EGFP-tubuline en DsRed2 in pCAX vectoren. De neuronen werden afgebeeld op de volgende dagen in vitro (DIV): Fase 1 (1DIV), Fase 2 (1DIV), Stage 3 (2DIV), Fase 4 (11DIV) en fase 5 (32DIV). Schaal bar is 20μm.

Discussion

Dit protocol voor het kweken van embryonale hippocampale en corticale neuronen muis werd ontwikkeld als een wijziging van de bank-protocol, dat rat neuronen ^1,2 gebruikt. We hebben gebruik gemaakt van deze protocol voor het kweken van muis en de hamster neuronen ook ^3,4,5,6,7. Dit protocol werkt even goed voor zowel de hippocampus en neocorticale neuronen en is vergelijkbaar met een protocol gepubliceerd door Meberg en Miller ^8. Over het algemeen gebruiken we de hippocampus neuronen voor de lange termijn, cultuur, omdat ze zijn goed gekarakteriseerd en een meer gevestigde modelsysteem. Bovendien zijn ze waarschijnlijk een meer homogene populatie van neuronen dan neocortex bevatten. Echter, neocorticale neuronen gekweekt met behulp van dit protocol ook te overleven en zo ook te onderscheiden (ongepubliceerde gegevens). We routinematig gebruik van de hippocampus en neocorticale neuronen voor korte termijn cultuur. Dissectie van de neocortex resulteert ook in aanzienlijk meer neuronen (1.5x10 ⁶ neuronen per paar van cortex) dan de hippocampus dissectie (2.5x10 ⁵ neuronen per paar hippocampus), waardoor het een betere keuze van materiaal voor Western blotting, bijvoorbeeld.

Zoals met elke primaire cultuur, is het essentieel om het minimaliseren van de tijd die nodig is vanaf de dood van het dier aan de beplating van de cellen. Over het algemeen neemt 10-20 dissecties te worden constant snel bij dissectie en plating. Ook bij het werken met de Lonza Nucleofector, is het essentieel om snel te werken tijdens de elektroporatie procedure, aangezien de levensvatbaarheid van de neuronen snel afneemt als ze links in de nucleofection buffer.

Een groot deel van onze beeldvorming wordt uitgevoerd met een totaal inwendig reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM). Dit type van microscopie is alleen geschikt voor imaging enkele honderden nanometers buiten de dekglaasje aan. Daarom is de gebieden van de neuronen die we regelmatig beeld, de axonale groei kegel en dendritische spines, moeten direct worden gehandeld op grond van het dekglaasje. Zo maken we gebruik van lage dichtheid culturen die gliale voeding nodig hebben voor de lange termijn cultuur. We hebben gebruik gemaakt een hogere dichtheid culturen (> 2x10 ⁴ cellen / cm ^2), zonder dat gliale feeder lagen, voor de lange termijn culturen en vond dat ze heel goed overleven met weinig voeding. Echter, de dendritische spines van deze neuronen zijn vaak te ver weg van het substraat om de afbeelding in TIRFM, hoewel ze gemakkelijk kan worden gedetecteerd met wide-field microscopie of confocale microscopie.

In de meeste van ons onderzoek hebben we transfecteren neuronen voor plating, en hebben belicht fluorescent-gelabelde eiwitten voor maximaal drie maanden in cultuur. Deze lange termijn expressie van fluorescent-gelabelde eiwitten geeft ons het vertrouwen dat door gebruik te lage concentraties van DNA (1-2μg) we niet overexpressie artefacten produceren in de neuronen. Toch kan deze procedure ook worden gebruikt om de overexpressie van eiwitten studie als grote hoeveelheden DNA worden gebruikt (10-20 microgram). De plasmiden die we gebruiken om neuronen transfecteren bevatten meestal EGFP of mCherry fusie-eiwitten, hoewel we ook het etiket van de neuronale cytoplasma met DsRed2 of EGFP alleen. Deze electroporatie techniek werkt goed samen met een aantal vectoren. Wij geven de voorkeur plasmiden die een β-actine-promotor met een CMV enhancer en β-globine bevatten poly-A staart (pCAGGs of pCAX plasmiden) ^9, te wijten aan de relatief hoge niveaus van expressie, en het feit dat ze goed worden getolereerd door de neuronen in zowel de korte-en lange termijn cultuur. In het algemeen, eiwitten beginnen te uiten binnen ongeveer 4 uur in de platen en het niveau voldoende is voor beeldvorming te bereiken binnen 10-24 uur ^10. We hebben met succes gebruikt CMV-promoter-driven plasmiden op korte termijn culturen, maar hebben ontdekt dat ze een hoog niveau van overexpressie oorzaak die doden neuronen in de lange termijn cultuur. Toch hebben we vastgesteld dat de gliale conditionering van lage dichtheid culturen helpt bij het overleven van neuronen die getransfecteerd zijn met CMV-promoter gedreven plasmiden, in vergelijking met een hogere dichtheid (niet-gliale FED) culturen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Borate	Fisher Scientific	S93356	Store borate buffer at room temperature (RT).
Poly-d-Lysine	Sigma-Aldrich	P7886-100mg	Dissolve in 0.1M borate buffer. Sterile filter and store aliquots at -80°C.
Trypsin (10x)	Invitrogen	15090-046	Store aliquots at -80°C.
DNase (10x)	Sigma-Aldrich	DN25-1G	Store aliquots at -80°C.
MEM	Invitrogen	11095-080	Store at 4°C.
HBSS (10x)	Invitrogen	14185-052	Store at RT.
HEPES (100x)	Invitrogen	15630-080	Store at 4°C.
Penicillin/Streptomycin (100x)	Invitrogen	15140-122	Store aliquots at -80°C.
Horse Serum	Hyclone	SH3007403	Store aliquots at -80°C.
Trypsin/EDTA	Invitrogen	25200-056	Store at 4°C.
Neurobasal E (NB)	Invitrogen	21103-049	Store at 4°C.
B27 Supplement (50x)	Invitrogen	17504-044	Store aliquots at -80°C.
Glutamine (100x)	Invitrogen	25030-081	Store aliquots at -80°C
30% Glucose in NB (100X)	Fisher Scientific	BP350-500	Dissolve glucose in NB and sterile filter. Store at 4°C.
3.75M NaCl in NB (100X)	Fisher Scientific	BP358-1	Dissolve NaCl in NB and sterile filter. Store at 4°C.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH3007003	Store aliquots at -80°C.
Paraffin/Petroleum Jelly (3:1 w/w)	Fisher Scientific	Paraffin – P31-500 Petroleum – P66-1	Combine in conical tube and melt in boiling water.
Concentrated Nitric Acid (HNO3)	Fisher Scientific	A509-212	Store at room temperature. Can be reused several times. Discard if it yellows.
5mM cytosine –B-D-arabinofuranoside hydrochoride (AraC) in NB (1000X)	Sigma-Aldrich	C6645	Dissolve AraC in NB and sterile filter. Store at -80°C
*Most reagents that we store at -80°C can be stored at -20°C as well. Storing them at -80°C lengthens their shelf life and results in slightly more consistent cultures.