Saponina permeabilizadas preparação de fibras em conjunto com a análise de fosforilação oxidativa fornece respirométrico de avaliação integrada da função mitocondrial. Respiração mitocondrial em estados fisiológicos e patológicos pode refletir várias influências regulamentares, incluindo as interações mitocondrial, morfologia e bioquímica.
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Artigo de método
Avaliação fosforilação oxidativa respirométrico em saponina-fibras cardíacas permeabilizadas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Investigação da função mitocondrial representa um parâmetro importante da fisiologia cardíaca, como as mitocôndrias estão envolvidas no metabolismo energético, estresse oxidativo, apoptose, envelhecimento, Encefalomiopatias mitocondriais e toxicidade de drogas. Diante disso, tecnologias para medir a função mitocondrial cardíaca estão na demanda. Uma técnica que emprega uma abordagem integrativa para medir a função mitocondrial é respirométrico fosforilação oxidativa análise (OXPHOS).
O princípio da avaliação OXPHOS respirométrico é centrado em torno de medir a concentração de oxigênio utilizando um eletrodo de Clark. À medida que o feixe de fibras permeabilizadas consome oxigênio a concentração de oxigênio, no declínio câmara fechada. Usando protocolos selecionados substrato inibidor desacoplador-titulação, os elétrons são fornecidos para sites específicos da cadeia de transporte de elétrons, permitindo a avaliação da função mitocondrial. Antes da análise da função mitocondrial respirométrico, mecânica e química técnicas de preparação são utilizados para permeabilizar o sarcolema das fibras musculares. Permeabilização química emprega saponina para seletivamente perfurar a membrana celular, mantendo a arquitetura celular.
Este artigo descreve minuciosamente os passos envolvidos na preparação saponina de pele fibras cardíacas para medições de consumo de oxigênio para avaliar OXPHOS mitocondrial. Além disso, solução de problemas conselhos, bem como substratos específicos, inibidores e desacopladores que podem ser usados para determinar a função da mitocôndria em locais específicos da cadeia de transporte de elétrons são fornecidos. Importante, o protocolo descrito podem ser facilmente aplicadas ao tecido cardíaco e esquelético de vários modelos animais e amostras humanas.
Protocolo
1. Preparação do Reagente
- A solução de relaxamento e de preservação (RP Solution) é preparada como descrito anteriormente, com pequenas modificações 1. Resumidamente, a solução consiste em RP 2.77mM CAK EGTA 2, K 2 7.23mM EGTA, imidazol 20mM, ditiotreitol 0,5 mM, taurina 20mM, 50mM K-MES, 6,56 MgCl 2, 5,7 ATP, fosfocreatina 14.3mm, pH 7,1, ajustado à temperatura ambiente (RT). Filtrar a solução através de um filtro 0,45 mM para esterilizar. Divida em 15 porções mL (tubos Falcon de polipropileno) e armazenar a -20 ° C Veja a discussão para as receitas.
- A Solução respirometria mitocondrial (MiR05) é prepa....
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Discussão
A saponina técnica das fibras cardíacas permeabilizadas oferece um compromisso único entre in vitro e in vivo de avaliação do consumo de oxigênio mitocondrial OXPHOS. Vantagens desta técnica incluem o aumento da relevância fisiológica em comparação com mitocôndrias isoladas como arquitetura celular é preservada. Enquanto a membrana plasmática é degradado, as estruturas de membrana intracelular, incluindo 12 mitocôndrias, 14, retículo sarcoplasmático 14, miofilamentos eo citoesquel.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este estudo foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde e Canadá Genoma. JS realiza premiação salário apoio da Heritage Foundation Alberta para a investigação médica, Heart and Stroke Foundation of Canada e da Associação de Diabetes do Canadá. O laboratório gostaria de agradecer a assistência técnica de instrumentos Oroboros durante a aquisição da técnica de fibra saponina permeabilizadas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Etanol a 100% | Fisher Scientific | HC600 | |
| Etanol 70% | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenosina 5′sal monopotássico de difosfato diidratado (ADP) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albumina de soro bovino essencialmente livre de ácidos graxos–gratuito | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antimicina A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ácido ascórbico | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenosina 5′cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractilosídeo | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Carbonato de cálcio | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cianeto p-(trifluorometoxi) fenilhidrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Citocromo c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonina | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Ditiotreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Etilenoglicol-bis-(2-amino–tiletílico)-N,N,N′,′ácido tetraacético (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Ácido glutâmico | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamina | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Ácido lactobiônico | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Cloreto de magnésio hexaidratado (MgCl2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Ácido málico | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,’-Tetrametil-p-fenilenodiamina diidrocloridrato (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomicina | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Fosfocreatina | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Cloreto de Potássio | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Hidróxido de Potássio | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Cianeto de potássio | Fluka | 60178 | |
| Fosfato monobásico de potássio | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenona | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Pentobarbital de sódio | Ceva Saúde Animal | 1715 138 | Conc. 54,7 mg/ml |
| Piruvato de sódio | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Ácido succínico | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sacarose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurina | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Xilazina | Bayer AG | Rompun | |
| ddH₂O2O | |||
| Gelo | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml | VWR international | 89004-368 | |
| Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml | VWR international | 89004-364 | |
| Pinça de joalheiro reta | George Tiemann && Cia. | 160-50B | |
| Pinça Curva para Ourives | George Tiemann && Cia. | 160-57B | |
| Tesoura cirúrgica reta | George Tiemann && Cia. | 105-402 | |
| Lâmina Cirúrgica Estéril | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μm Filtros de seringa | VWR international | CA28145-485 | |
| pHmetro | VWR international | CA11388-308 | |
| Placas de Petri de vidro | VWR international | 89000-300 | |
| Placas de cultura de tecidos de poliestireno, 12 poços | VWR international | 82050-926 | |
| Agitador de Placa | VWR international | 97042-594 | |
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Balança de Pesagem | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μSeringa Micro Hamilton | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μSeringa Micro Hamilton | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μsiringa micro de l Hamilton | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Garrafas Squeeze Nalgene | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Placas de Pesagem de Poliestireno | VWR international | 89106-750 | |
| Microscópio de dissecação | Olympus Corporation |
Referências
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , S....
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Reimpressões e permissões
