En metod för att leverera morpholinos direkt i zebrafisk otocyst på 24hpf har utvecklats. Använda mikroinjektion av morpholinos in i lumen öron vesikler och elektroporation att genomföra penetration, kunde vi kringgå effekten av morpholinos på hjärnan och få effekter som är specifika för innerörat.
På senare år har elektroporation blivit en populär teknik för in vivo transfektion av DNA, RNA och morpholinos i olika vävnader, inklusive ögat, hjärnan och somites av zebrafisk. Fördelen med elektroporation jämfört med andra metoder för genetisk manipulation är att specifika vävnader kan riktas både rumsligt och tidsmässigt, för införandet av makromolekyler genom tillämpning av elektrisk ström. Här beskriver vi användandet av elektroporation för transfecting MIF och MIF-liknande morpholinos in i vävnader i utvecklingsländerna innerörat i zebrafisk. I tidigare studier, MIF morpholino sprutas in embryon vid 1 – till 8-cells skede resulterade i omfattande morfologiska förändringar i nervsystemet och ögat samt örat. Genom att rikta vävnader i innerörat vid senare stadier i utvecklingen, kan vi bestämma de primära effekterna av MIF i utvecklingsländerna innerörat, i motsats till sekundära effekter som kan uppstå påverkan av andra vävnader. Genom att använda phalloidin och acetylerade tubulin färgning för att studera morfologi av nervceller, neuronala processer och celler hår i samband med den bakre gula fläcken, kunde vi bedöma effekten av elektroporation som en metod för riktade transfektion i zebrafisk innerörat. Den öron blåsor i 24hpf embryon injicerades med morpholinos och electroporated och har sedan jämförts med embryon som hade fått någon behandling eller hade endast injiceras eller electroporated. Embryon som injicerats och electroporated visade en minskning i antal hår cell, minskade innervation av statoacoustic ganglion (SAG) och färre nervceller SAG jämfört med kontrollgrupper. Våra resultat visade att direkt leverans av morpholinos i otocysts i senare skeden undviker de icke-specifika nervsystemet och neurala effekter krönet av morpholinos levereras på 1-8 cellen scenen. Den tillåter också undersökning av effekter som riktar sig till innerörat och inte sekundära effekter på örat från primära effekter på hjärnan, neural crest eller periotic mesenkym.
Vi har framgångsrikt infört MOS antisense oligonukleotid i örat av 24 HPF zebrafisk embryo. Embryon som togs upp efter injektion och elektroporation var lönsamma. Om embryona överlevde elektroporation, växte på en normal priser jämfört med embryon som hade fått någon behandling, liksom embryon som bara hade injicerats och embryon som bara hade electroporated.
Vi observerade effekterna av MIF och MIF-liknande MOS efter örat injektion och elektroporation genom märkning med phalloidin och acetylerade tubulin. Phalloidin färgning av aktin filament i sensoriska hårceller i bakre gula fläcken visar att elektroporation i MIF och MIF-liknande MO vid 24-HPF steg orsakade förändringar i hårceller och / eller siffror sinneshår jämfört med embryon som bara injicerades med MOS (Figur 3). Denna minskning av antalet hårceller ligger i linje med resultaten av Shen et al. (In) som MOS till MIF och MIF-liknande orsaka en minskning av antalet hårceller i saccular makula. Minskningen i antalet hårceller i embryon som injicerades med MOS och electroporated visa att elektroporation får stöd i att flytta MOS över cellmembranen, vilket ökar omfattningen av morfologiska effekter jämfört med embryon där öron vesikler var bara injiceras. Förändringar i morfologi statoacoustic ganglion observerades genom acetylerade tubulin färgning. Omfattningen av innervation av statoacoustic ganglion påverkades, eftersom embryon som injiceras och electroporated visar minskad förgrening av neurites (Figur 5). Det kan också vara nedsatt kondensering av ganglieceller och / eller minskat antal ganglion celler, eftersom acetylerad tubulin färgningen är betydligt minskat i embryon som var både injiceras och electroporated. Eftersom MIF har visat sig vara avgörande för nervsystemets utveckling (Suzuki et al., 2004) kan förändringar ses efter elektroporation vara ett resultat av ökad transfektion av MIF och MIF-liknande MO lösning i neuroblast cellerna.
Elektroporation av antisens oligo morpholinos direkt i ett u-vävnad är ett användbart verktyg för att kontrollera uttrycket av en gen under den vävnad utveckling, både rumsligt och tidsmässigt, i embryot. Elektroporation av MIF och MIF-liknande MOS i vävnaden i innerörat resulterade i onormal morfologi av både bakre gula fläcken och statoacoustic ganglion. Det var en minskning av antalet av sensoriska hårceller i den bakre gula fläcken med embryon som hade injicerats och electroporated i jämförelse med embryon som hade fått någon behandling eller med embryon som antingen hade endast injiceras eller bara electroporated. Det fanns också en minskning i graden av innervation av den bakre sensoriska lapp med statoacoustic ganglion och storleken på SAG. Elektroporation är en värdefull metod för transfecting makromolekyler till specifika vävnader, med fördel för att observera de primära effekterna av just DNA, RNA eller MO i önskad vävnad och diskriminera dessa från sekundära effekter på andra vävnader, inklusive hjärnan, neural crest och periotic mesenkym på innerörats utveckling (Barald och Kelley, 2004).
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats med bidrag från Dövhet Research Foundation att Yc S och NSF (IOS 0.930.096) till KFB.
KFB: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, 3R01DC004184-08W1 , NSF DBI 0.832.862, NSF IOS 0.930.096
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments | ||
M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments | ||
Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
Shrink Tubing | Supply | Newarck Electronics | 03F3172 | |
Socket Crimp Terminal | Supply | DigiKey | 82PECT-ND | |
Capillaries | Supply | Stoelting Company | 50613 | |
Modeling clay | Supply | |||
Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon | ||
6 well plastic plates | Supply | Falcon |