Summary
Vi utvecklade en alternant bakdelen lossning modell i möss. Den främsta fördelen med våra bakdelen lossning svans-ringen metoden jämfört med konventionell Morey-Holton tail-grepp tekniken är en enkel okomplicerad procedur som minimerar stressen på djuret.
Abstract
Den Morey-Holton bakdelen lossning (HU) är en allmänt accepterad National Aeronautics and Space Administration (NASA) markbaserade modell för att studera ur bruk-atrofi hos gnagare 4-6. Vår studie utvärderade ett alternant metod till guldmyntfot Morey-Holton HU tail-grepp teknik i möss. Femtiofyra honmöss (4-8 mån.) Var HU under 14 dagar (n = 34) eller 28 dagar (n = 20). Återhämtning från HU bedömdes efter 3 dagar av normal bur förflyttningar efter HU (n = 22). Åldrad matchas möss (n = 76) fungerade som viktbärande kontroller.
Innan HU en svans ring bildades med en 2-0 sterila kirurgiska stål som passerat 5: e, 6: e eller 7: e inter-vertebrala diskutrymme och formas till en ring från vilken mus avbröts. Vertebrala plats för svansen-ringen valdes på lämpligt balansera djurens kroppsvikt utan att störa avföring.
Vi bestämde framgången för denna roman HU teknik genom att bedöma kroppsvikt före och efter HU, grad av soleus atrofi, och adrenal massa efter HU. Kroppsvikt för möss före HU (24,3 ± 2.9g) hade ingen signifikant nedgång direkt efter 14d i HU (22,7 ± 1.9g), 28d i HU (21,3 + 2.1g) eller efter 3 dagar återhämtning (24,0 ± 1,8 g) . Soleus muskelmassa minskade kraftigt (-39,1% och -46,6%) efter HU i 14 dagar och 28 dagar (p <0,001). Efter tre dagars återhämtning soleus massa ökade kraftigt till 74% av kontroll värderingar. Binjurarnas vikt av HU möss var inte annorlunda jämfört med kontroll möss.
Framgången för våra nya HU-metoden framgår av underhåll av djurens kroppsvikt, motsvarande binjurarnas vikt körtel och soleus atrofi efter HU, motsvarande förväntade litteratur värden 2, 7, 8. Den främsta fördelen med denna HU metod är bland annat: 1) enkel svans undersökning under upphängning, 2) minskade sannolikheten för cyanotiska, inflammerad, och / eller nekrotisk svansar frekvent med svans-tejpning och HU, 3) ingen möjlighet att möss tugga dragkraft tejp och kommer ut av fjädring apparater, och 4) en snabb återhämtning och normal bur aktivitet direkt efter HU.
Protocol
Pre-kirurgiska instrument / material
- Avbitare / tänger
- Slingervävnader 2 x 2 "kuddar
- Värmedyna
- Silvernitrat pinnar
- Sterila operationshandskar
- Isofluran inhalationsanestesi
- Klorhexidinglukonat 4% (antiseptisk kirurgiska skrubba)
- Sterila 2-0 kirurgiskt stål sutur
- 25 X 5 / 8 En nål (autoklaverad)
- Hemostat (autoklaverad)
- Kirurgiskt stål sutur
Kirurgi
- Skapa ett sterilt område. Följ steril förfarande.
- Bedöva mus med 2 - 3% isofluran.
- Placera musen på värmedyna.
- Skrubba svans med Klorhexidin lösning.
- Leta 5, 6 eller 7: e utrymmet mellan ryggkotorna (mellan två beniga knölar på svansen, börjar räkna från slutet av kroppsbehåring, vid basen av svansen).
- Använd Hemostat och 25G nål för att göra en pilot hål mellan två kotor, in i utrymmet mellan ryggkotorna.
- Använd avbitare för att klippa stål suturen 10 cm lång.
- Ta bort nålen och sätter stål sutur genom hålet, 5 cm av sutur på vardera änden av svansen.
- Varje sida av svansen bör ha + 5 cm av sutur.
- Placera tummen spets på svansen.
- Använd din fria hand och vind stålet sutur på toppen av tummen och vrid ändarna för att bilda en stor ögla. Såret eller cirkulär del bör + 3 mm långa.
- Ta bort tummen.
- Klämma en del av sutur med hemostat och böj den till en mindre loop, i slutet av som bifogas så nära som möjligt till twist på den ursprungliga stora slingan.
- Klipp bort överflödigt tråd, och böj den tvinnade tråden tillbaka.
- Om det finns någon överskott blödningar, kan du stoppa det med silvernitrat pinnar.
- Stäng av isofluran och placera mus i ett enda hus bur att återhämta sig i 5-7 dagar före bakdelen lossning. Svansen ringarna fastnar om mer än en mus ligger tillsammans.
1. Bakdelen Lossning Förfarande
Material
- Storlek 10-24 X 4 skruvar, en per djur.
- Nylon låsmutter storlek 10 - 24, en per djur.
- Vingmuttern storlek 10 X 24, två per djur.
- Brickstorlek ¼ X 1, två per djur.
- Fiske vridbar med karbinhake storlek # 6, 1-11/16 ", och en per djur.
- Metall symaskin undertråd. En per djur.
- Litet gem för S-formad krok, en per djur
- Tänger.
- 2 x 2 "gasväv.
- 2 "svart papper bindemedel klämmor.
- Silvertejp / lab band.
- 1-3/8 "Pläterade slitsade stålstång som sträcker sig något utöver det fulla längd på buren
- 50cm x 40cm x 20cm bur (råtta bur).
- Vattenflaska med böjda rör.
- Rostfritt stål, U-formad för att stödja vattenflaska.
Cage Setup
- Lägg 1-38 "tätas slitsade stålstång över toppen av buren, och tejpa fast den tidsmässigt ner med silvertejp.
- Skruva 1 vingmuttern till maskinen skruven, sätta in en bricka och sätter maskinen skruven tråg den slitsade stålplåt ± 15 cm från kanten av buren.
- Lägg till ytterligare en bricka och vingmutter. Dra åt båda vingmuttrar, men inte dra åt, eftersom det kommer att bli nödvändigt att göra justeringar senare.
- Sätt maskinen skruven genom hålet i mitten av spolen.
- För att förhindra att spolen från att falla av, skruva av muttern nylon låset till slutet av maskinen skruven. Spolen ska vridas fritt.
- Sätt karbinhake från fiske svängas runt den nedre delen av spolen.
- Använd tång för att bilda en S-formad krok från gemet. (Klipp 2 cm från gemet till en krok).
- Sätt i ena änden av S-formad krok genom hålet för fiske vridas och nypa fast locket med tång.
- Sätt U-formad tråd, parallellt med maskinen skruven på insidan av buren sidan och böj ändarna tillbaka för att stödja en full vattenflaska.
- Sätt in vattenflaska i den U-formade tråd, med spicket nedåt, men inte vidröra botten.
- Böj 2 "bindemedlet klämma öppna, så att de kan inte stänga stänga. Precis lagom spänning för att hålla 3 till 4 bitar av mat i det utan att det faller ut. Detta hindrar kraft klämma ur krossa mat, eller hårdare tag mot musen näsan.
- Sätt 3 till 4 bitar av gnagare chow i pärm klämman.
Bakdelen Lossning av Mouse
- Sätt den öppna änden av S-formad krok genom den mindre ringen av svansen ringen.
- Justera musens höjd genom att dra åt eller lossa den nedre vingmuttern på maskinen skruven. De nedre extremiteterna bör inte viktbärande. När den optimala höjden uppnås dra åt den övre vingmuttern.
- Flytta vattenflaska, och U-formad tråd så att musen inte kan klättra upp på spicket med dess bakben. Säkra vattenflaskan med silvertejp på sidan av buren.
- Placera pärm klämma med mat på botten av buren så att musen inte kan klättra upp på det, tejpa ner med silvertejp.
- Upprepa proceduren om fler än ett djur är bakbenen lossas på andra sidan av buren. Hus två djur per bur, utrymme djuren så att de kan nästan vidrör varandra.
- Använd 2 X 2 gasbinda så att löst linda svansen på musen på fisken svivel. Använd en liten bit tejp att linda runt gasväv, säkra gasväv till svansen. Detta steg är viktigt för att förhindra att svansen från hängande nedåt, vilket leder till blod sammanslagning i svanstippen och att svansen blir nekrotisk.
- Tillsätt en liten mängd COB sängkläder till buren. Lägg inte för mycket sängkläder annars musen kommer från en hög av sängkläder och försöker läsa bakben på sängar.
2. Representativa resultat:
Att etablera framgången med svansen-ringen HU teknik vi uppmätt vikt djurkroppen innan svansen ringen kirurgi och före och efter HU och återhämtning, soleus muskelmassa, och adrenal massa i alla grupper.
Kroppsvikt för möss i hela försöket visas i Figur 1. Kroppsvikt för möss innan svansen ringen kirurgi (24,7 ± 3,5 G) skilde sig inte signifikant efter 5 dagars återhämtning från svansen ringen kirurgi (24,3 ± 2.9g) innan HU. Inte heller kroppsvikt minskade betydligt direkt efter 14 dagars HU (22,7 ± 1.9g), 28 dagar HU (21,3 + 2.1g), eller efter 3 dagar återhämtning från HU (24,0 ± 1,8 g). Även HU i 14 och 28 dagar resulterade i en liten (-6,8% respektive 12%) men icke-signifikant förlust i kroppen massa, helt möss återhämtat sig till sin redan HU kroppsvikt efter 3 dagars återhämtning. Livsmedelskonsumtion för rörliga kontroll möss och HU möss visas i figur 3. Genomsnittliga dagliga födointaget var inte annorlunda i HU möss under 28 dagar jämfört med kontroller.
Vi observerade betydande soleus muskelatrofi efter HU i 14 och 28 dagar (-39,1% och -46,6%) indikerar att den effektiva HU förfarande (figur 2). Vidare denna grad av atrofi är förenlig med den förväntade litteraturen värden för 2-4 veckor HU 2, 7, 8. Efter tre dagar av återhämtning från HU soleus massa ökade kraftigt till 74% av kontroll värderingar. Soleus massa i återhämtningen gruppen var betydligt större än både HU grupperna, men ändå betydligt mindre än ambulatorisk kontroll djur.
Binjurarnas vikt mättes som en indikator på djurens stress, både vänster och höger binjurar klippts och vägs. Den genomsnittliga vikten var jämförbar för kontroll och HU möss möss i alla grupper (Figur 4).
Tidigare på råttor har vi visat att andelen framgångsrika för det antal djur i början av HU i förhållande till det antal djur som avslutade HU utan att komma ur sin vila apparater (på grund av djur tugga igenom tail-dragkraft band) var 10 ute av 12 använder Morey-Holton teknik 1. Ingen av de möss (n = 54) i denna studie kom aldrig ner från avstängning före slutförandet av HU period. Vi hade dock en mus att det utvecklat en kraftigt inflammerad svans. När inflammationen blev uppenbart, tog vi bort svansen ringen så att det inflammerade området att läka, och därefter släpps en svans-ringen för att slutföra länge HU.
Förr i tiden när vi har använt Morey-Holton metod för HU, eliminerar vi vanligtvis 1-2 möss / grupp eftersom de kommer ut av suspensionen apparaten. Med leden-ringen metoden fanns inga episoder av möss misstag kommer ut ur HU apparaten under HU för 14 eller 28 dagar (n = 54 möss).
Figur 1. Kroppsvikt Ändringar (medelvärde ± SD). Förkortningar: CON: viktbärande kontroll möss (n = 76), Pre-HU: alla möss före HU (n = 54), HU14: möss bakbenen lossas i 14 dagar (n = 34), HU28: möss bakbenen lossas för 28 dagar (n = 20), REC: bakbenen lossas möss får bur återhämta sig under 3 dagar (n = 22). Inga signifikanta skillnader i kroppsvikt observerades mellan grupperna.
Figur 2. Soleus muskelatrofi (medelvärde ± SD). Förkortningar: CON: viktbärande kontroll möss (n = 76), HU14: möss bakbenen lossas i 14 dagar (n = 34), HU28: möss bakbenen lossas i 28 dagar (n = 20), och REC: bakbenen lossas tillåtet möss till bur återhämta sig under 3 dagar (n = 22). * Väsentliga skillnader (p <0,001) än viktbärande kontroll (CON). δSignificantly olika (p <0,01) än både HU grupper.
467fig3.jpg "alt =" Bild 3 "/>
Figur 3. Livsmedelskonsumtion (medelvärde ± SD). Genomsnittliga dagliga matintag (g / dag) under viktbärande och bakdelen lossning. Förkortningar: viktbärande kontroll möss (n = 76), HU: möss bakdelen unloaded14 - 28 dagar. Inga signifikanta skillnader mellan CON och HU grupper observerades.
Figur 4. Adrenal Massa (medelvärde ± SD). Förkortningar: CON: viktbärande kontroll möss (n = 76), HU14: möss bakbenen lossas i 14 dagar (n = 34), HU28: möss bakbenen lossas i 28 dagar (n = 20), och REC: bakbenen lossas tillåtet möss till bur återhämta sig under 3 dagar (n = 22). Inga signifikanta skillnader observerades mellan grupperna.
Discussion
Vi utvärderade ett alternativ metod i bakdelen lossning möss, som vi fast beslutna att vara mycket framgångsrik. Svansen-ringen metod som beskrivs här har använts för långsiktig bakdelen fjädring, och att studera återhämtning efter HU. Under varje av dessa villkor fanns det inga tecken på misslyckande att anpassa sig, vilket framgår av stabila födointag, kroppsvikt, och binjurarnas vikt i möss. Denna svans-ringen HU tekniken är enkel att utföra och kan lätt integreras med mycket lite kirurgiska praktiken.
Det finns flera fördelar med svans-ringen metod jämfört med de traditionella Morey-Holton 5, 6 metod. Först huden och ring implanteringsstället på att svansen är alltid synliga, så om det uppstår problem det är uppenbart omedelbart, inte bara i slutet av den perioden. Andra djur inte kan få ut av suspensionen apparaten när som helst under HU, undanröja behovet av att fatta ett beslut om att hålla en mus eller inte i datamängden. Dessutom bryr mössen inte ringen apparater och när de frigörs från HU för återvinning de inte mixtra med sina svansar, vilket möjliggör en sömlös återhämtningsfas efter HU. Slutligen bakbenen lossas möss med svansen-ringen metoden bibehålla sin kroppsvikt bättre än möss bakbenen lossas från Morey-Holton tail-grepp teknik. I våra händer efter 14 dagar av HU vi observerade en liten (-6,8%) men icke-signifikant förlust i kroppen-massa. I Ingalls et al. Observerade en signifikant -12% minskning av kroppsvikten hos möss efter 14 dagar av HU av Morey-Holton metod 3. Även Ingalls inte rapporterade binjurarnas vikt verkar det som om vår svansen-ringen metoden ger mindre stress på musen (binjurarnas vikt i vår HU möss är inte annorlunda än kontroller) och bättre underhåll av kroppsvikten under hela bakdelen lossning period.
Sammanfattningsvis var en svans ringmetoden i bakdelen lossning utvecklad och testad på möss HU i 14 och 28 dagar, och på möss tillbaka till buren återhämtning för 3 dagar efter HU. På grundval av binjurarnas vikt, body mass-och födointag, möss verkar ha anpassat sig väl till svans-ringen apparater. Svansen-ringen bakdelen lossning metoden är ett användbart, enkelt alternativ till den traditionella Morey-Holton bakdelen lossning teknik.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Andrew J Dunn, en enastående grundutbildningen doktorand i vårt laboratorium, för hans tekniska stöd och omsorg om djuren. National Institute of Health bidrag HD058834 och University of Missouri Life Sciences stipendier finansierade detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wire cutters/pliers | Ace Hardware | 84-056 | |
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-901 | |
| Heating pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Silver nitrate applicators | ARZOL | 0001-2 | |
| Isoflurane,USP | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| Chlorhexidine Gluconate 4% | Purdue Products L.P. | NDC 67618-200-01 | |
| Sterile 2-0 surgical steel suture | Ethicon Inc. | SS-28 | |
| 25 X 5/8 A gauge needle | Terumo Medical Corp. | NN 2516R | |
| Hemostat/ needle holder | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Size 10-24 X 4 machine screws | Hillman The Fastener Center | 90272 | |
| Nylon lock nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180141 | |
| Wing nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180243 | |
| Fender Washer size ¼ X 1 | Hillman The Fastener Center | 290012 | |
| Fishing swivel with snap hook size #6, 1-11/16” | Bass Pro Shop | 38-481-554-01 | |
| Metal sewing machine bobbin. | Singer Instruments | 45785 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| 2” black paper binder clamps. | Office Depot | 308957 | |
| Scotch Multi-Use Duct Tape | Office Depot | 790710 | |
| 1-3/8” Plated slotted steel bar | Home Depot | 548932 | Extends slightly beyond the full length of the cage |
| 50cm X 40cm X 20cm cage (rat cage | Alternative Design Manufacturing | RC88D-PC | |
| Water Bottle | Alternative Design Manufacturing | WB16FS | |
| Stainless Steel wire | Small Parts, Inc. | SWX-4029 | U-shaped wire to support water bottle |
References
- Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. An alternative method for hindlimb unweighting. J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).
- Fitts, R. H., Metzger, J. M., Riley, D. A., Unsworth, B. R. Models of disuse: a comparison of hindlimb suspension and immobilization. J Appl Physiol. 60, 1946-1953 (1986).
- Ingalls, C. P., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading. Journal of Applied Physiology. 87, 386-390 (1999).
- Morey, E. Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness. BioScience. 29, 168-172 (1979).
- Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight. Bone. 22, 83-88 (1998).
- Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading rodent model: technical aspects. J Appl Physiol. 92, 1367-1377 (2002).
- Thomason, D. B., Booth, F. W. Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting. J Appl Physiol. 68, 1-12 (1990).
- Thomason, D. B., Herrick, R. E., Surdyka, D., Baldwin, K. M. Time course of soleus muscle myosin expression during hindlimb suspension and recovery. J Appl Physiol. 63, 130-137 (1987).
