RNAi הפרעה על ידי הזרקה לתוך dsRNA תסיסנית עוברים
Summary
התערבות RNA הוכח יעיל מאוד כדי לנתח את תפקוד הגן<em> תסיסנית</em> פיתוח קנה הנשימה. פרוטוקול מפורט בשימוש על ידי ג'יאנג במעבדה להזריק dsRNA לעוברי לטוס ביטוי גנים מציאה מודגם. טכניקה זו יש פוטנציאל ההקרנה גנים הדרושים להתפתחות רקמות איבר<em> תסיסנית</em>.
Abstract
בדיקה גנטית היא אחת השיטות החזקות ביותר עבור השגת תובנות לתוך תהליך ביולוגיות מורכבות 1. במהלך השנים שיפורים רבים וכלים מניפולציה גנטית הפכו זמינים תסיסנית 2. זמן קצר לאחר הגילוי הראשוני על ידי Frie מלו ו 3 כי RNA גדילי כפול ניתן להשתמש מציאה את פעילותם של גנים בודדים Caenorhabditis elegans, התערבות RNA (RNAi) הוצגה כדי לספק גישה חזקה גנטית הפוכה לנתח פונקציות הגן בהתפתחות איבר תסיסנית 4, 5.
איברים רבים, כולל ריאות, כליות, כבד, מערכת כלי הדם, מורכבים ברשתות צינורי מסועפת תחבורה חיוני נוזלים או גזים 6, 7. ניתוח של היווצרות תסיסנית קנה הנשימה מספקת מערכת מודל מצוינת ללמוד את המורפוגנזה של איברים אחרים צינורי 8. תסיסנית ברקלי פרויקט הגנום חשף מאות הגנים באים לידי ביטוי במערכת קנה הנשימה. כדי לחקור את המנגנון המולקולרי ו הסלולר של היווצרות צינור, האתגר הוא להבין את התפקידים של גנים אלה בהתפתחות קנה הנשימה. כאן, אנו תיאר שיטה מפורטת של dsRNA זריקה לתוך העובר תסיסנית כדי ביטוי גנים בודדים מציאה. אנחנו בהצלחה הפילו dysfusion אנדוגני (פרע) ביטוי גנים באמצעות זריקה dsRNA. פרע הוא חלבון bHLH-PAS לידי ביטוי בתאים היתוך קנה הנשימה, והוא נדרש ענף היתוך קנה הנשימה 9, 10. פרע RNAi בוטלו לחלוטין הביטוי פרע וגרם פגם היתוך קנה הנשימה. שיטה זו פשוטה יחסית מספקת כלי לזיהוי גנים requried עבור tissure ופיתוח איבר תסיסנית.
Protocol
Discussion
נוכח שיטת הזרקה dsRNA כאן מאפשר ניתוח רגיש מאוד מהיר של תפקוד הגן בהתפתחות תסיסנית קנה הנשימה. שיטה זו עלולה להיות מיושם לנתח תפקוד הגן רקמות אחרות ופיתוח איברים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות קרוז סטיבן עבור נוגדן dysfusion cDNA, פרע וזבובים 1118 W.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | ||
| Picospritzer III picopump | Parker Precision Fluidics | 051-0500-900 | ||
| Micro-pipettes | Fisher | 21170M | ||
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 |
References
- St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-219 (1992).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster. Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Misquitta, L., Paterson, B. M. Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1451-1456 (1999).
- Horowitz, A., Simons, M. Branching morphogenesis. Circ. Res. 103, 784-795 (2008).
- Hogan, B. L., Kolodziej, P. A. Organogenesis: molecular mechanisms of tubulogenesis. Nat. Rev. Genet. 3, 513-523 (2002).
- Ghabrial, A., Luschnig, S., Metzstein, M. M., Krasnow, M. A. Branching morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 623-647 (2003).
- Jiang, L., Crews, S. T. Dysfusion transcriptional control of Drosophila tracheal migration, adhesion, and fusion. Mol. Cell. Biol. 26, 6547-6556 (2006).
- Jiang, L., Crews, S. T. The Drosophila dysfusion basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS gene controls tracheal fusion and levels of the trachealess bHLH-PAS protein. Mol. Cell. Biol. 23, 5625-5637 (2003).
