Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

Summary

Frühe Entwicklung der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, wird durch eine Reihe von Zell-Form verändert, dass auch für die Bildgebung Ansätze geeignet sind, geprägt. Dieser Artikel beschreibt grundlegende Werkzeuge und Methoden für die Live-konfokale Abbildung von Drosophila Embryonen erforderlich ist, und wird auf eine Zelle Formveränderung genannt Zellularisierung konzentrieren.

Abstract

Die Entwicklung von Drosophila melanogaster Embryo durchläuft eine Reihe von Zellform Veränderungen, die sehr gut für konfokale Bildgebung leben. Zellform Veränderungen in-the-fly sind analog zu denen in höheren Organismen, und sie fahren Gewebemorphogenese. Also, in vielen Fällen hat ihre Studie direkte Implikationen für das Verständnis menschlicher Erkrankungen (Tabelle 1) ^1-5. Auf der sub-zellulärer Ebene sind diese Zellform Veränderungen das Produkt der Aktivitäten reicht von der Genexpression bis Signaltransduktion, Zellpolarität, Zytoskelett-Umbau-und Membran-Handel. Somit stellt die Drosophila-Embryo nicht nur den Kontext zu Zellform Veränderungen zu bewerten, da sie Gewebemorphogenese beziehen, sondern bietet auch eine völlig physiologischen Umgebung, die sub-zellulären Aktivitäten, die Form-Zellen zu studieren.

Die hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um Bild einer bestimmten Zelle Formveränderung genannt Zellularisierung. Zellularisierung ist ein Prozess der dramatischen Plasmamembran Wachstum, und es letztendlich wandelt die Syncytial Embryo in die zelluläre Blastoderm. Das heißt, bei der Interphase der Mitose-Zyklus 14, der Plasmamembran gleichzeitig stülpt sich um jede ~ 6000 kortikal verankert Kerne auf ein Blatt von primären Epithelzellen zu generieren. Zähler zur vorherigen Vorschläge, ist Zellularisierung nicht von Myosin-2 Kontraktilität ⁶ angetrieben, sondern wird weitgehend durch Exozytose von Membran aus internen Shops ⁷ angeheizt. So ist Zellularisierung ein hervorragendes System zur Untersuchung von Membran-Handel während der Zellform Veränderungen, die Plasmamembran Invagination oder Erweiterung erfordern, wie Zytokinese oder Quer-Tubuli (T-Tubulus) Morphogenese in der Muskulatur.

Beachten Sie, dass dieses Protokoll einfach auf die Abbildung von anderen Zellform Veränderungen in-the-fly Embryo angelegt und erfordert nur geringe Anpassungen wie die Änderung der Phase der Embryo-Entnahme oder Verwendung von "Embryo Kleber", um den Embryo in einer bestimmten Orientierung (Tabelle montieren 1) ^8-19. In allen Fällen wird der Workflow im Grunde die gleichen (Abbildung 1). Standard-Verfahren für das Klonen und Drosophila Transgenese werden verwendet, um stabile fliegen Aktien, die ein Protein von Interesse exprimieren, fusioniert mit Green Fluorescent Protein (GFP) oder dessen Varianten vorzubereiten und diese Fliegen bieten eine erneuerbare Quelle von Embryonen. Alternativ sind auch fluoreszierende Proteine ​​/ Sonden direkt in fly Embryonen über einfache Mikro-Injektion Techniken ^9-10 eingeführt. Dann, je nach Entwicklungs-Event-und Zell-Form zu ändern, die abgebildet werden, sind Embryonen gesammelt und inszeniert von Morphologie auf einem Binokular und schließlich positioniert und montiert für Zeitraffer-Bildgebung an einem konfokalen Mikroskop.

Protocol

1. Montieren Embryo Sammlung Cups

1. Schneiden Sie die unten aus einer 100 ml Tri-Mais Becherglas mit einer Rasierklinge, so dass die Kante so glatt wie möglich. Die Tassen sind einfacher zu handhaben, wenn Sie schneiden auch die drei Ecken von der Spitze, obwohl dies nicht zwingend erforderlich.
2. Schneiden Sie ein Quadrat aus Drahtgitter (6 cm x 6 cm). Auf einer vorgewärmten heißen Platte, innerhalb einer Abzugshaube, Schicht des Platzes aus Drahtgitter auf einem Stück von schweren Aluminium-Folie. Schieben Sie den Schnitt unteren Rand der Tasse fest auf den heißen Masche. Warten Sie ein paar Sekunden, und heben Sie die Tasse mit dem Mesh jetzt ange....

Discussion

Das Protokoll beschriebenen wird die Live-, konfokale Bildgebung von einer Reihe von Zellform Veränderungen in den Entwicklungsländern zu fliegen Embryo zu ermöglichen. GFP Aktien für die Bildgebung kann durch einen individuellen Labor (Tabelle 2) hergestellt werden, aber viele dieser Bestände sind auch öffentlich verfügbar von Zentren wie Bloomington Drosophila Stock Center an der Indiana University ( http://flystocks.bio.indiana.edu ) und Fliegenfalle Stock Cente.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Objektträger	Fisher Scientific	12-550-343
Deckgläser 25x25	Fisher Scientific	1 2-524C
Spritzflaschen (H2O)	Fisher Scientific	02-897-11
50 ml Falcon-Röhrchen	Fisher Scientific	14-432-22
Kolben für kleine Pipetten, 1 mL	Fisher Scientific	03-448-21
Szintillationsfläschchen mit Verschlüssen	VWR international	66021-533
Tri-Maisbecher, 100 mL	Elektronenmikroskopie	Sciences 60970
BD Falcon Petrischale 60x15mm	Fisher Scientific	08757 100B
BD Falcon Cell Sieb	Fisher Scientific	08-771-2
Gelbe Pipettenspitzen	Rainin	L200
Edelstahlgitter, 304, 12x24	Kleinteile, Inc.	CX-0150-F-01
Glas 5¾ Zoll Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20B
P4 Filterpapier	Fisher Scientific	09-803-6F
Gummibänder	Office Max	A620645
Scotch doppelseitiges Klebeband, ½ Zoll	Office Max	A8137DM-2
Robert Simmons Expression Pinsel E85 rund #2	Jerry" s Artarama	56460
Dumont #5 Pinzette High Precision Inox	Elektronenmikroskopie Sciences	72701-DZ
Rasierklingen	VWR international	55411-050
Halogencarbon Öl 27	Sigma-Aldrich	H 8773
Heptan	Fisher Scientific	H360-1
BD Bacto Agar	VWR international	90000-760
Saccharose	Sigma-Aldrich	S7903
p-Hydroxybenzoesäure	Sigma-Aldrich	H5501
Red Star Active Trockenhefe	LeSaffre	15700
Papierhandtücher, C-Fold	Kleenex
Heavy Duty Aluminiumfolie	Reynolds Wrap
Bleach	Austin' s A-1 Kommerzieller
100% Apfelsaft	Ocean Spray oder Tree Top