Summary
Una técnica para la realización de microscopía intravital del ganglio linfático inguinal (LN) se describe. Dicha técnica permite en tiempo real,
Abstract
Los ganglios linfáticos (LN), que se encuentra en todo el cuerpo, son un componente integral del sistema inmunológico. Sirven como un sitio para la inducción de respuesta inmune adaptativa y, por tanto, el desarrollo de las células efectoras. Como tal, LNS son clave para luchar contra los patógenos invasores y mantener la salud. La elección de la LN para el estudio es dictado por la accesibilidad y el modelo deseado y el ganglio linfático inguinal se encuentra bien y fácilmente compatible con los estudios de modelos biológicamente relevantes de la piel y la infección de las mucosas genitales.
El LN inguinal, al igual que todos los LN, tiene una extensa red microvascular dotarlo de sangre. En general, esta red microvascular incluye la arteriola de alimentación principal de la LN que, posteriormente, las ramas y se alimenta vénulas de endotelio alto (HEV). HEV están especializados para facilitar el tráfico de células inmunes en la LN en tanto la homeostasis y la infección. ¿Cómo HEV regular el tráfico en la LN en ambas circunstancias es un área de intensa exploración. El LN alimentar las arteriolas, tiene una influencia directa la corriente en el HEV y es la principal fuente de nutrientes y la sangre rica en células en la LN. Además, los cambios en las arteriolas de alimentación están implicados en la facilitación de la inducción de la respuesta inmune adaptativa. La microvasculatura LN tiene una importancia obvia en el mantenimiento de un óptimo suministro de sangre a la LN y la regulación de flujo de células inmunes en la LN, que son elementos cruciales en la función LN adecuada y la respuesta inmune posteriormente.
La capacidad para estudiar la microvasculatura LN en vivo es la clave para esclarecer cómo el sistema inmune y la microvasculatura interactúan y se influyen unos a otros dentro de la LN. A continuación, presentamos un método para imágenes in vivo de los ganglios linfáticos inguinales. Nos centramos en la imagen de la microvasculatura de la LN, prestando especial atención a los métodos que aseguren el estudio de la salud de los vasos, la capacidad de mantener la imagen de los vasos viable en un número de horas, y la cuantificación de la magnitud de los buques. Métodos para la perfusión de la microvasculatura con drogas vasoactivas, así como el potencial de localizar y cuantificar el tráfico celular también se presentan.
Microscopia intravital de la LN inguinal permite la evaluación directa de las funciones microvasculares y en tiempo real de la interfaz directa entre las células inmunes, la LN, y la microcirculación. Esta técnica potencial para ser combinado con técnicas inmunológicas muchos y etiquetado de células fluorescentes, así como manipular a estudiar la vasculatura de LN otros.
Protocol
1. Preparación de los reactivos
- Los reactivos que se utilizarán durante todo el experimento debe estar preparado antes de iniciar el protocolo quirúrgico. Tenga en cuenta que todas las soluciones se realizaron utilizando una técnica estéril.
- Solución salina fisiológica (PSS) es el mejor preparado en dos componentes: una solución de sal básica y una solución de bicarbonato de sodio. Preparar dos soluciones a la concentración de 20X y almacenar a 4 ° C. El bicarbonato de sodio a 20X es 360.0mM NaHCO3 (84.01g/mol) y la solución de sal básica en 20 veces la concentración es 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mm de CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), y MgSO 4 • 7H 23.4mm 2 O (246.48g/mol). Las soluciones deben ser preparadas en dH 2 O y los productos químicos hay que añadir uno a la vez y se agita hasta que la solución es clara antes de añadir el producto químico siguiente
- Preparar 2L de PSS mediante la dilución de volúmenes iguales de bicarbonato de sodio y la solución de sal básica y la dilución de la concentración 1X (para dos 2L de PSS diluir 100 ml de cada solución de bicarbonato de sodio y sal básica en dH 2 O
- Lugar matraz aforado de 2 litros que contiene PSS PSS y en 37 ° C baño de agua. Equilibre la solución con 5% de CO 2 / gas balance de nitrógeno durante 1 hora antes de comenzar el procedimiento quirúrgico.
- Sustancias químicas vasoactivas (fenilefrina por ejemplo, la acetilcolina, nitroprusiato de sodio) están mejor preparados a una concentración 1M en dH2O y se almacena en 100μl alícuotas a -20 ° C.
2. Preparación de los animales
- Determinar el peso del ratón y administrar la dosis inicial de pentobarbital de sodio en 90mg/Kg por inyección intraperitoneal. A lo largo del procedimiento, el ratón es continuamente monitoreado para el plano de anestesia a través de una pizca dedo del pie y un examen cuidadoso de la frecuencia respiratoria. Inyecciones adicionales de pentobarbital de sodio debe ser administrado como sea necesario para mantener a 20mg/kg avión anestesia. El plano quirúrgico de anestesia se mantiene de acuerdo con las regulaciones federales e institucionales tal como se indica en el protocolo de cuidado de los animales aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo (ACUC) de la Universidad de Columbia Británica del Norte.
- Eliminar el vello de la zona abdominal y el flanco / cadera en máquina de afeitar. Suprimir los pelos sueltos de gasa con alcohol y palmaditas en la zona con cinta adhesiva. Esto es suficiente ya que este procedimiento experimental es terminal.
- Coloque el ratón sobre una tabla quirúrgica clara en posición supina y conectar el ratón a la junta con cinta adhesiva de cada pata de la mesa. La temperatura corporal se mantiene a través de una lámpara de calor externa y controlado a través de un termómetro rectal para asegurarse de que la hipotermia no ocurre como resultado de la anestesia.
3. Procedimiento Quirúrgico
- Durante todo el procedimiento quirúrgico garantizar tejido expuesto se mantiene siempre con una solución equilibrada superfused PSS calentado. También es importante no entrar en contacto con los vasos de interés con los instrumentos quirúrgicos o lesionar los vasos mediante la colocación de mucha fuerza en ellos mediante la manipulación de tejido adiposo y tejido conectivo alrededor de ellos.
- Coloque el ratón en el ámbito de disección. Hacer una incisión a lo largo de la superficie ventral de la cavidad abdominal y retraer la piel hacia la columna vertebral del ratón.
- Una vez que la piel se retrae de manera que la LN es fácilmente visible, el pin de la piel en un pedestal de transparencia Sylgard 184.
- Eliminar la capa delgada de tejido conectivo que cubre los alrededores de la LN
- Desactive la superposición de tejido adiposo y rodean el ganglio linfático hasta el lecho microvascular se expone. El segmento arterial principal establece junto a la LN, y que comúnmente se superpone a la vénula. La cirugía tarda aproximadamente 30 minutos.
4. Análisis de imágenes y de buques
- Una vez que el segmento de la flota de interés se expone bajo el microscopio de disección, asegurar la preparación en el microscopio intravital. Tenga en cuenta que los restos de animales en el tablero quirúrgico clara, mientras que en el microscopio intravital durante toda la duración del experimento. La temperatura corporal se mantiene a través de una lámpara de calor y se mide a través de un termómetro rectal como se describe en la sección de cirugía. El avión de la anestesia también se controla durante todo el experimento descrito en la sección 2.1.
- Configure la superfusión y las líneas de succión. Superfusión de PSS se produce por gravedad desde un depósito, en el depósito de la chaqueta de agua caliente (la camisa de agua se distribuye y se calienta por el baño de agua circulante) se perfunde en un 5% de CO 2 de nitrógeno equilibrada, y hacia abajo una línea de goteo a una velocidad de 10 ml / min. Una línea de succión debe ser utilizado para continuar tirar PSS superfused lejos de la preparación. Tenga en cuenta que antes de la prueba las líneas de succión y la camisa de agua se limpian y se almacenan después de cada experimento. Esto asegura la esterilidad antes de la siguiente experimento.
- Compruebe la temperatura de la PSS superfusing. Ajuste la temperatura de labaño de agua circulante y / o la tasa de superfusión PSS para alcanzar una temperatura de ~ 37 ° C a través de la preparación.
- Deje que el sistema vascular se equilibre con PSS por lo menos durante 60 minutos y cuantificar el diámetro del vaso con la pinza de vídeo. Por lo general, el diámetro del vaso se debe determinar en varios puntos (por ejemplo, a los 40, 50, y 60 minutos) para asegurar el buque se ha estabilizado.
- Evaluar la salud de los buques que utilicen un agonista del músculo liso específica (por ejemplo fenilefrina, PE) y un agonista específico del endotelio (por ejemplo la acetilcolina, ACh). Concentración de agonista se debe ajustar en función del agonista, pero para el PE y Ach, el buque debe ser evaluado en cada concentración de suma acumulativa (10-5M y 10-9M) a la superfusate. Cada aplicación de agonistas deben estar separadas por una fase de lavado (normalmente 30 minutos) con PSS hasta que el barco vuelve a un diámetro de descanso.
- Tras la evaluación de la salud de los vasos, con posterioridad fármacos vasoactivos, marcaje fluorescente, y la célula de seguimiento experimentos pueden llevarse a cabo.
- Tras el final del experimento los animales se da una sobredosis de pentobarbital sódico. El animal es luego controlada para garantizar que no hay respuesta a pellizcar los dedos y la falta de movimiento respiratorio o latido del corazón. En el momento en que esto es seguido por dislocación cervical.
5. Los resultados representativos:
Tras el período de equilibrio de la preparación debe dar una imagen clara que permita la identificación tanto de las arteriolas y vénulas que los suministros de los ganglios linfáticos inguinales. Debe haber un mínimo de células adiposas que rodean los vasos para permitir las paredes de las arteriolas y vénulas que se observa claramente en las pinzas de vídeo que se superponen para calcular el diámetro del vaso. El punto esencial de una preparación exitosa es la arteriola tiene un rico suministro de sangre se mueve a través de la luz y que hay un grado significativo del tono vascular (es decir, la arteriola tiene la capacidad de vasoconstricción y vasodilatación de músculo liso y endoteliales agonistas específicos, respectivamente) .
Figura 1. Imagen de microscopía intravital de alimentación linfáticos inguinal nodo arteriola (flecha roja) la alimentación de los ganglios linfáticos se equilibró con solución salina fisiológica y corriendo al lado de la vénula principal (flecha verde).
Figura 2. Respuesta normal a la fenilefrina superfused vasoactivo (PE) por la suma acumulativa de solución salina fisiológica de las concentraciones de 10 -9 M a 10 -5 M. La presencia de una vasoconstricción robusta es sugerente de la función normal del músculo liso en la arteriola.
Figura 3. Respuesta normal a la acetilcolina superfused vasoactivo (ACh) por adición acumulativa de solución salina fisiológica de las concentraciones de 10 -9 M a 10 -5 M. La presencia de una vasodilatación robusta sugiere normal presente la función endotelial en la arteriola.
Discussion
Microscopia intravital del ganglio linfático inguinal se presenta aquí ofrece la posibilidad de microvasculatura imagen de los ganglios linfáticos en vivo. Por lo tanto, facilita un medio de directa, observación en tiempo real. Imagen de la microvasculatura LN es un sitio único que permite estudiar la relación entre la respuesta inmune y la vasculatura. El uso de este preparado, el enfoque puede ser dirigido específicamente a la respuesta inmunológica, las alteraciones en el sistema vascular, o en la interacción entre los dos.
Al igual que con todos los métodos experimentales, la microscopía intravital estándar tiene ventajas y limitaciones. Estándar de IVM, tales como la preparación se describe aquí, se puede modificar fácilmente, y ha sido previamente demostrada por los autores para que la microscopía de epifluorescencia a través de la introducción de colorantes indicador fluorescente o etiquetados poblaciones de células. A pesar de IVM norma no da la posibilidad de imágenes tridimensionales y la localización, como sería dado por microscopía de dos fotones o angiografía, el seguimiento de la célula sigue siendo alcanzado en dos dimensiones, permitiendo la célula a célula y la interacción célula-vascular que se observadas y cuantificadas y, en relación con la administración in vivo y posterior tinción con anticuerpos fluorescentes se pueden utilizar para dar datos sobre la expresión de proteínas / marcador en tiempo real.
En particular, técnicas de imagen alternativas requieren un entorno estático para las imágenes; de sujeción de la zona de la cirugía o la adición de un cubreobjetos sobre una preparación plana que se usa frecuentemente. Esto limita, si no elimina, la posibilidad de perfusión activa mediadores vasculares o de otro tipo sobre la preparación para evaluar la integridad vascular y la fisiología, etc, o el uso de otras técnicas tales como experimentos de la vasodilatación a cabo en la preparación de IVM. Además, la norma IVM no requiere una preparación totalmente plano y no se ve afectada por el movimiento, como la generada por la respiración del animal. Esto permite IVM estándar que se utiliza en más áreas quirúrgicas con mayor reproducibilidad. Esto se ejemplifica en la preparación de los ganglios linfáticos inguinales se describe aquí. Dado el tamaño y la forma de los ganglios linfáticos, la preparación no se pueden hacer planos sin dañar el tejido y la localización de los nodos da lugar a movimientos significativos debido a la respiración animal. Estas cuestiones serían difíciles de superar por otros métodos, pero son fáciles de tratar con el uso de la preparación IVM estándar descrito.
En resumen, la preparación se detalla más arriba se puede combinar con cualquier número de otros bioquímicos, vasculares y / o técnicas inmunológicas, como la transferencia de los subconjuntos de células activadas o etiqueta, la inducción de la hipoxia y la sobre-expresión de agotamiento de los mediadores vasculares. Sin embargo, otras aplicaciones dependen de la salud de la preparación inicial. Por lo tanto, es vital para probar siempre la salud de la vasculatura se va a examinar y evaluar. Puntos clave para lograr una preparación de la salud se garantiza la preparación es constante perfundidos con PSS equilibrado a la temperatura corporal y minimizar el contacto y la tensión puesta en el área quirúrgica durante la cirugía.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo está financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la Fundación Canadiense para la Innovación de la Universidad de Columbia Británica, Centro de Investigación de la Sangre y la Universidad de Columbia Británica del Norte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Nitroprusside | Sigma-Aldrich | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pentobarbitol |
References
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