Method Article

Всего Запись сотовый от органотипической Подготовка Кусочек Неокортекс

DOI:

10.3791/2600

⸱

June 3rd, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это протокол для подготовки и поддержания неокортекса подготовки ломтик в органотипической культуры с целью создания электрических записей из пирамидных нейронов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы изучали выражения и функциональные роли напряжения закрытого калиевые каналы в пирамидных нейронов коры головного мозга крысы. Из-за отсутствия конкретных фармакологических средств для этих каналов, мы взяли генетический подход к манипуляциям с каналом выражения. Мы используем органотипической подготовки культура (16) в целях сохранения морфологии клеток и ламинарного структуры коры головного мозга. Как правило, мы изолировать острой неокортекса срезов на послеродовой 8-10 дней и сохранить ломтики в культуре в течение 3-7 дней. Это позволяет нам изучать нейронов на того же возраста тем, кто в нашей работе с острыми кусочками и сводит к минимуму развитие избыточных возбуждающими связями в срез. Мы записываем с визуально-определены пирамидных нейронов в слоях II / III или V с помощью инфракрасной подсветки (ИК-) и дифференциальный интерференционный контраст микроскопии (ДВС-синдром) с целыми зажим патч ячейки в текущем или напряжения зажимом. Мы используем biolistic (Gene пушка) трансфекции дикого типа или мутантного ДНК калиевого канала манипулировать выражением каналов для изучения их функции. Трансфекции клетки легко идентифицировать по epifluorescence микроскопии после совместной трансфекции кДНК зеленый флуоресцентный белок (GFP). Мы сравниваем записи трансфицированных клеток на соседние, untransfected нейронов в одном слое из того же фрагмента.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка Перед Днем нарезки

Мы находим его более эффективным в автоклаве хирургических инструментов и подготовить решения до дня нарезки.

  1. Автоклав инструментов. (Хирургия и нарезки выполняются под полу-стерильных условиях). Автоклав следующие пакеты, индивидуально упакованные в автоклаве бумаги:
    • Хирургия пакета: шпателем, № 22 скальпеля ручку лезвие, ножницы, пинцеты
    • Нарезки пакета: 3 ручки (лезвие-холдинг ручку и 2 ванных обеспечение ручки) и защитный кожух (вмещает лезвие от среза: Campden Vibroslice, # MA572), в индивидуальной упаковке (потому что он буде....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы изучали выражения и функциональные роли напряжения закрытого калиевые каналы в пирамидных нейронов коры головного мозга крысы (4, 9-11). Из-за отсутствия конкретных фармакологических средств для этих каналов, мы используем генетический подход для управления каналом выражения (1,14,15,17-19). Мы используем органотипической подготовки культуры (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Редактировался подход Stoppini и др. (16), в целях сохранения морфологии клеток и ламинарного структуры коры головного мозга. Выделим о.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Маюми Сакураба и Ребекка Foehring за выдающиеся технической помощи. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить д-ра. Родриго Андраде за помощь в реализации органотипической культуры нарезать и biolistic протоколы трансфекции и д-р Жанна Nerbonne за предоставление нам кДНК конструкции для трансфекции. Эта работа была поддержана NIH грант: NS044163 от NINDS (для RCF).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Хирургия / трансфекции / культура:

  1. Мозг Slicer: Campden Vibroslice # MA572 инструменты Всемирного Precision, Сарасоте, штат Флорида, США
  2. Генной пушки Система: Bio-Rad Гелиос # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Альфред Нобель Drive, Hercules, CA 94547)
    • Включает в себя: генной пушки, гелий сборки шланг с регулятором, трубы приготовительной станции (# 165-2418), шприц комплект, Tefzel трубы, трубки резак, оптимизации набора (# 165-2424), трубы резак
    • Bio-Rad Гелий Регулятор (# 165-2413)
    • одноразовые принадлежности для Helios от Bio-Rad:
      • 1,6 мкм микроносителях Золото: # 165-2264
      • Tefzel труб: # 165-2441
  3. Инкубатор: Forma Научно модель № 3110 (Термо-научная: (866) 984 - 3766).

СМИ:

  1. Лошадиной сыворотки: Hyclone доноров лошадей # SH 30074. (Hyclone, 925 Запад 1800 Юг, Логан, Юта 84321)
  2. HMEM (Минимальная Основные Медиа плюс HBSS и HEPES, не глютамин: Lonza BioWhittaker Каталог # 12-137F): GIBCO / Invitrogen, (800) 955 - 6288, вариант 1.
  3. HBSS (GIBCO Хэнкс солевой буфер, # 24020-117): GIBCO / Invitrogen, (800) 955 - 6288, вариант 1.
  4. MEM (GIBCO минимальным необходимой среде, # 12360-038), GIBCO / Invitrogen, (800) 955 - 6288, вариант 1.
  5. 250 мл Millipore фильтр 0,2 мкм: # SC6PU02RE
  6. Пластиковые пипетки Перевод: Fisher # 13-711-20.
  7. 50 мл Millipore steriflip 0,22 мкм фильтр (# SCGP00525)

Элементы 6-8 получить по адресу: Fisher Scientific, 1241 посол Blvd, PO Box 14989, Сент-Луис, Миссури 63132.

Запись:

  1. Внесите стекла: Гарвардский GC150TF-10: Гарвардский аппарата, 84 октября Hill Road, Холлистон, штат Массачусетс 01746
  2. Саттер Р-87 горизонтальных съемник электрода: Саттер Instrument Company, один Digital Drive, Novato, CA 94949
  3. Axon инструменты Multiclamp 700B усилителя: Molecular Devices, Inc 1311 Орлеан Драйв, Sunnyvale, CA 94089-1136
  4. PClamp 10 сбора данных программного обеспечения: Molecular Devices, Inc, 1311 Орлеан Драйв, Sunnyvale, CA 94089-1136
  5. lectrode положение контролируется с Саттер ROE-200 манипуляторов и PC-200 контроллер: Саттер Instrument Company, один Digital Drive, Novato, CA 94949.
  6. Микроскоп: Olympus BX-50WI прямой микроскоп с ИК-ДИК оптики
  7. ИК-чувствительная камера Oly-150 (Olympus) или DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 Roeske Северо-авеню, Мичиган-Сити, IN 46360).

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).
  2. Buonomano, D. V.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Organotypic SliceWhole Cell RecordingNeocortical SlicesBiolistic TransfectionGFP ExpressionPatch ClampInfrared MicroscopyDifferential Interference ContrastCurrent ClampVoltage Clamp

Related Articles