Summary
Laten we zien hoe harige wortel composiet planten kunnen worden gebruikt om de plant-Rhizobium interacties en nodulatie studie in het moeilijk te transformeren soorten
Abstract
Net als bij Agrobacterium tumerfaciens, kan Agrobacterium rhizogenes overbrengen vreemde DNA in plantencellen gebaseerd op de autonome root-inducerende (Ri) plasmide. A. rhizogenes kan harige wortelvorming op plantaardige weefsels en vorm composiet planten na transformatie. Op deze samengestelde planten, een deel van de geregenereerde wortels zijn transgeen, het dragen van de wild type T-DNA en de kunstmatige binaire vector, terwijl de scheuten nog steeds niet-transgene, dienen om energie en de groei te ondersteunen. Deze harige wortel samengestelde planten zullen niet produceren transgene zaden, maar er zijn een aantal belangrijke kenmerken die deze samengestelde planten zeer nuttig te maken in plant-onderzoek. Eerste, met een breed gastheerbereik, A. rhizogenes kan transformeren vele plantensoorten, vooral tweezaadlobbigen, waardoor genetische manipulatie in een verscheidenheid van soorten. Ten tweede, A. rhizogenes direct infecteren weefsels en explantaten, geen weefselculturen voorafgaand aan de transformatie is nodig om composiet planten te verkrijgen, waardoor ze ideaal zijn voor de transformatie van recalcitrante plantensoorten. Bovendien kan transgene wortelweefsels worden gegenereerd in een kwestie van weken. Voor Medicago truncatula, kunnen we krijgen transgene wortels in zo kort drie weken sneller dan normaal floral dip Arabidopsis transformatie. Over het geheel genomen de harige wortel composiet plant-technologie is een veelzijdig en nuttig instrument om genfuncties studie en wortel-gerelateerde fenotypes. Hier laten we zien hoe de harige wortel composiet planten kunnen worden gebruikt om de plant-Rhizobium interacties en nodulatie studie in het moeilijk te transformeren soorten M. truncatula.
Protocol
Het volgende protocol is gebruikt om harige wortel composiet planten te genereren in een modelgewas soort M. truncatula. Soortgelijke protocollen zijn aangepast voor ten minste acht plantensoorten 1-4. We gebruikten M. truncatula harige wortel composiet planten gen functies in de wortel en nodule ontwikkeling te bestuderen. Het protocol werd gescheiden in vier delen: 1) het bereiden van plantaardige materialen, 2) het genereren van harige wortel samengestelde planten; 3) symbiotische rhizobia infectie en 4) transgene wortel identificatie. We gebruikten de binaire vector die het groen fluorescerend eiwit (GFP) gen als verslaggever voor het screenen van transgene wortel in samengestelde planten 3. In vergelijking met antibiotica op basis van selectie, GFP-gebaseerde screening is snel, eenvoudig en goedkoop. In ons bouwen, is de ER-expressie-geoptimaliseerde GFP-gen aangestuurd door de super ubiquitine-promoter, die een sterke constitutieve GFP-signalen in transgene wortels heeft, zodat u gemakkelijk onderscheid te maken tussen transgene en niet-transgene wortels.
1. Voorbereiden Plant Materialen
- M. truncautla zaden worden geoogst van planten gekweekt in een kas (50% relatieve vochtigheid, 16 / 8 uur licht / donker, 22/18 ° C dag / nacht temperatuur). Rijpe zaden kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C.
- Ongeveer 100 zaden worden scarified in 10 ml geconcentreerd zwavelzuur (95-98%, Sigma-Aldrich, MO) gedurende 10 minuten met periodieke schudden.
- De zaden zijn 5-7 keer gespoeld met steriel water onder zacht schudden.
- De zaden worden dan geweekt in water bij kamertemperatuur gedurende 6 uur en bewaard bij 4 ° C voor 36-48 uur om ontkieming synchroniseren.
- Ongeveer 20-30 zaden worden verspreid op een vochtige papieren filters geplaatst in een petrischaal. Ze worden gehouden bij 22 ° C, met 16 / 8 uur licht / donker-cyclus, en 40 μmol.m -2. S-1 lichtintensiteit, gedurende 5-6 dagen.
- Gekiemde zaailingen worden overgedragen in de bodem en in kas voor een maand.
2. Het genereren van Hairy Root Composite Planten
- Binaire constructies dragen genen van belang zijn omgezet in A. rhizogenes met behulp van standaard protocollen. Wij hebben een reeks van binaire vectoren die het GFP-gen als een marker die screening van transgene weefsels te vergemakkelijken. Deze vectoren bevatten verschillende promotoren en hebben allemaal Gateway kloneringsplaatsen (Invitrogen, Carlsbad, CA) voor de over-expressie of silencing van gerichte genen 3,5.
- A. rhizogenes is gekweekt in 50 ml LB-medium met een geschikte antibiotica selectie bij 28 ° C gedurende 16-24 uur.
- De bacteriën worden verzameld en opnieuw gesuspendeerd tot een uiteindelijke concentratie van OD 600 = 0,3 in een stikstof-vrije plantenvoeding oplossing (tabel 1 en 6).
- Ter ondersteuning van harige wortel regeneratie, een gesteriliseerde ondersteunende matrix ("Rock Wol", Hummert International, Earth City, MO) is gesneden in stekkers van ongeveer 3 cm 3. We plaatsen 4 pluggen in een petrischaal.
- Een gat is prikte op elkaar aansluiten met behulp van een pipet tip om het inbrengen van explantaten te vergemakkelijken. A. rhizogenes (5 ml) wordt toegevoegd aan elke stekker.
- Een shoot gedeelte met 2-3 okselknoppen is uitgesneden door een schuine snede. De Explantatie wordt dan in de stekker, en gegroeid bij 22 ° C voor ongeveer drie weken. We houden de Medicago explantaten zonder water voor de eerste 10 dagen, daarna, geef ze water met 5 ml stikstof-vrije oplossing wanneer dat nodig is. We vonden dat het verwijderen van het apicale meristeem kan de vorming van onvoorziene wortels verminderen.
3. Symbiotische rhizobia (Sinorhizobium Meliloti) Infectie
- Na drie weken, zullen sommige onvoorziene wortels komen uit de steenwol. De harige wortel composiet planten worden overgebracht naar zand of vermiculiet (gesteriliseerd), met of zonder de steenwol. Ze worden gekweekt in de kas bij 22 ° C, 16 / 8 uur licht / donker-cyclus, en 300 μmol.m -2. S -1 lichtintensiteit voor een week.
- Voorafgaand aan de rhizobia infectie, S. meliloti 1201 is gekweekt in 50 ml gistextract-mannitol medium voor 7 dagen bij 30 ° C (tabel 2, en 6,7).
- Geresuspendeerd rhizobia cellen worden verdund tot een uiteindelijke concentratie van OD 600 = 0,08 met behulp van stikstof gratis voeding oplossing. Een 10-ml vers surseance van S. meliloti werd toegepast voor elke samengestelde plant tot de vorming van knobbeltjes induceren.
4. Transgene Root Identificatie
- Twee weken na de rhizobia inoculatie, de samengestelde planten up-geworteld door wassen in water. De wortels kunnen gemakkelijk worden gescheiden van zand of perliet in water.
- We plaatsen de harige wortels onder een UV-microscoop (Nikon SMZ1500, excitatie 460-500nm, 505nm Dichroic, Barrier meer dan 510nm). De transgene wortels zijn GFP positieve en de onvoorziene wortels GFP negatief. We dan verzamelen de wortels according het GFP-signaal, en tel de knobbel getallen, het meten van de wortel lengte, en bereken laterale wortel dichtheid. De GFP negatieve wortels worden gebruikt als controle.
5. Vertegenwoordiger van Result
In ons experiment, de nieuwe haarwortels geregenereerd uit de explantaten in 2-3 weken na het A. rhizogenes inoculatie. Onder de UV-microscoop, transgene wortels het dragen van de GFP-gen vertonen sterke groene fluorescentie (Fig 1). De hoeveelheid van geregenereerd wortels en het deel van de GFP positieve wortels hangt af van de voorwaarden van explantaten en de groei omgeving van composiet plants.On gemiddeld 25% van de geproduceerde wortels werden transgene harige wortels 3. Om de transformatie efficiëntie, 1) te verhogen de plastic afdekking ondergang, zoals te zien op de video, is genoeg om de vochtigheid in de groei lade voor de eerste paar dagen te behouden, en planten vereisen slechts weinig water in de eerste paar dagen. Overmatig water is schadelijk voor harige wortelvorming, 2) de concentratie van Agrobacterium innoculant is belangrijk voor de transformatie. Overmatige hoeveelheid cellen niet nuttig om harige wortel vorming of de vorming van knobbeltjes. Voor de vorming van knobbeltjes, de gieter oplossing moet worden stikstof-vrij, anders zal weinig knobbeltjes vormen.
De harige wortel composiet planten kunnen worden gegenereerd met behulp van zaadlobben of entact zaailingen als het uitgangsmateriaal. Slechts geringe wijzigingen van de bovengenoemde protocol ncessary te harige wortels van andere weefsels 8 te genereren. Belangrijk is dat iedere harige wortel is een onafhankelijke modificatie. Daarom is de fenotypes waargenomen in een composiet plant zijn de som van de verschillende transforamtion gebeurtenissen die moest worden bevestigd door de herhalingen in meerdere samengestelde planten
Figuur 1. A. Transgene wortels kunnen worden gesorteerd uit harige wortels. B. Knobbeltjes werden gevormd in de harige wortel composiet planten. We plaatsten 4-weken oude M. truncatula harige wortel planten onder de UV-microscoop en het GFP-positieve wortels gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd. (Rode pijl: GFP wortel; Gele pijl: niet-GFP root)
| Voorraad | g/200ml | ml bouillon / liter |
| MgSO 4 0.7 H 2 O | 12,3 | 2 |
| CaCl 2 .2 H 2 O | 14,7 | 4 |
| K 2 HPO 4 0.3 H 2 O | 6.8 | 1 |
| K 2 SO 4 | 11 | 4 |
| Fe Cl 3 0.6 H 2 O | 0.49 | 2.5 |
| Micronutriënten | Zie hieronder | 1 |
| Micronutriënten | g per liter |
| H 3 BO 3 | 0.142 |
| MnSO 4. H 2 O | 0.077 |
| ZnSO 4 0.7 H 2 O | 0.1725 |
| CuSO 4 .5 H 2 O | 0.037 |
| NaMoO 4. H 2 O | 0.024 |
| CoCl 2. H 2 O | 0.0025 |
| NiSO 4 | 0.001 |
Tabel 1. Nitogen-vrije voeding oplossing
| K 2 HPO4 | 0.5g |
| NaCl | 0.1g |
| MgSO 4 · 7H 2 O | 0,2 g |
| Gist Extract | 0.4g |
| Mannitol | 10g |
| pH = 6,8 |
Tabel 2. Gistextract mannitol medium (per liter)
Discussion
Het genereren van harige wortel composiet plant is een snelle en eenvoudige methode om grote hoeveelheden van transgeen materiaal voor vele dicotyle soorten te verkrijgen. Hoewel deze methode kan geen transgene zaden kan produceren transgene materialen in een paar weken. De methode is vooral geschikt voor planten die moeilijk tot oprichting van weefsel culturen of het genereren van stabiele transformanten te hebben. In de loop der jaren, hebben we gebruik gemaakt van deze technologie om genfuncties, promoter functies, microRNA, wortel en laterale wortel ontwikkeling, defensie en abiotische stress respons, nodulatie en andere symbiotische processen, hormonale reacties, metabool profiel, gen profilering, proteoomanalyse, en studie andere biologische processen. Het protocol is robuust en herhaalbaar.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen dr. Chris Taylor (Ohio State University) bedanken voor de invoering van harige wortel-technologie om ons lab en Drs. Senthil Subramanian (South Dakota State University), Juan Zhang (Ludong University, Shandong China) voor het verbeteren van het protocol. We danken ook Dr Hao Cheng (Nanjing Landbouw Universiteit) voor het helpt bij het maken van deze video. Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidies van DOE (DE-SC0001295), NSF (MCB-0923779) en de USDA (2010-65116-20514) om OY
References
- Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant J. 43, 449-457 (2005).
- Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti. Plant J. 57, 171-183 (2009).
- Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).
- Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation. Plant Physiol. 144, 741-751 Forthcoming.
- Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots. Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).
- Vincent, J. A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , Blackwell Science Ltd. Oxford. 1-13 (1970).
- Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae. Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).
